基于Western Blot分析的华根霉液态发酵菌体形态与其膜结合脂肪酶生产间规律的研究

摘要

脂肪酶能够水解脂肪为甘油和脂肪酸,也可催化非水相酯合成,具有区域选择性、对映选择性和高底物专一性。用于有机相合成的、具有酯化或转酯化功能的脂肪酶的工业化生产对于酶催化合成手性化合物和精细化学品有重要意义。华根霉脂肪酶因其高酯化合成能力,在生物能源、香精香料等相关产业具有广泛应用潜力。前期研究发现,华根霉摇瓶水平液态发酵过程中,能够随机产生不同形态华根霉菌体,伴随菌体形态的改变,华根霉膜结合脂肪酶合成活性变化显著。本论文针对华根霉菌丝体形态进行液态发酵初步调控,进而利用Western Blot反应初步研究华根霉菌体形态与具有合成活性膜结合脂肪酶生产之间的关系,最后在发酵罐水平进行华根霉发酵初步调控并验证了所产脂肪酶在非水相合成短链脂肪酸酯的应用,摘要如下:
　　 (1)华根霉液态发酵摇瓶水平菌体形态初步调控。利用本研究室保藏的华根霉菌株(Rhizopus chinensis CCTCC M201021),在摇瓶水平研究了摇床转速、装液量、挡板条件、接种量、发酵液初始pH及橄榄油添加量等因素对华根霉菌体形态的影响,实现华根霉摇瓶水平不同菌体形态的初步调控。确定影响华根霉菌体形态的关键因素为装液量和挡板条件。块状菌体形成条件:装液量20mL/250 mL发酵摇瓶;摇床转速200 rpm;发酵液初始pH5.5;接种量5×107spores/mL;培养温度30℃。此条件下,华根霉菌体形态维持光滑块状,脂肪酶合成活性最高。通过调节装液量至40 mL及添加挡板能够分别获得球状菌体及散装菌体。
　　 (2)Western Blot分析华根霉菌体形态及其与合成活性膜结合脂肪酶生产的关系。制备得到华根霉膜结合脂肪酶(sRCL)抗血清并利用Protein A纯化得到sRCL的特异性多克隆抗体。利用sRCL特异性多克隆抗体,通过Western Blot反应,并结合脂肪酶活性分析,检测不同菌体形态下胞内酶、膜结合脂肪酶及胞外酶的产生及分布情况。结果显示,随着华根霉菌体形态不断聚集,华根霉膜结合脂肪酶积累量增加,对应脂肪酶合成活性增加明显。同时,菌体形态的改变显著影响不同区域脂肪酶的分布,即华根霉菌体聚集能够明显抑制脂肪酶由细胞内向胞外分泌。
　　 (3)发酵罐水平华根霉初步发酵调控。华根霉聚集态菌体有利于华根霉合成活性膜结合脂肪酶发酵水平的提高,但在普通机械搅拌发酵罐中华根霉无法形成聚集态菌体,导致无法有效获得具有有机相酯合成活力的膜结合脂肪酶。针对此问题,自行设计支撑网桶装置,使华根霉菌丝体能附着网桶生长,获得聚集态菌体。相对普通机械搅拌发酵罐中发酵产生的散装菌体,聚集态菌体脂肪酶合成酶活提高1倍左右,达到100 U/g。
　　 (4)华根霉脂肪酶非水相催化合成短链脂肪酸酯。在无溶剂反应体系中利用华根霉脂肪酶催化合成短链脂肪酸乙酯,结果表明,其不仅具有良好的催化能力,且与有机相反应体系相比,华根霉脂肪酶在外部脱水-无溶剂反应体系中催化己酸乙酯合成更为有效。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 脂肪酶简述

1.1.1 脂肪酶

1.1.2 根霉脂肪酶的生产

1.1.3 根霉脂肪酶的应用

1.2 丝状真菌菌丝体形态与发酵调控

1.3 华根霉脂肪酶研究背景及工作基础

1.4 本论文的研究意义和主要研究内容

1.4.1 本课题的研究意义

1.4.2 本论文的主要研究内容

第二章 实验材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基

2.2 方法

2.2.1 菌体培养与收集

2.2.2 膜结合脂肪酶的丙酮处理

2.2.3 脂肪酶的提取

2.2.4 膜结合脂肪酶的纯化

2.2.5 膜结合脂肪酶的SDS-PAGE分析

2.2.6 膜结合脂肪酶多克隆抗体的制备

2.2.7 脂肪酶的蛋白转印

2.2.8 免疫印迹分析

2.2.9 脂肪酶合成酶活及水解酶活的测定

2.2.10 蛋白质浓度的测定

2.2.11 华根霉脂肪酶发酵罐发酵

2.2.12 己酸乙酯检测

第三章 结果与讨论

3.1 华根霉菌丝体初步发酵调控

3.1.1 摇床转速对菌体形态及脂肪酶合成活性的影响

3.1.2 装液量对菌体形态及脂肪酶合成活性的影响

3.1.3 挡板对菌体形态及脂肪酶合成活性的影响

3.1.4 接种量对菌体形态及脂肪酶合成活性的影响

3.1.5 发酵液初始pH对菌体形态及脂肪酶合成活性的影响

3.1.6 橄榄油添加量对菌体形态的影响

3.2 华根霉膜结合脂肪酶合成活性与菌体形态关系的研究

3.2.1 抗原蛋白的制备

3.2.2 抗血清的提取及多克隆抗体纯化

3.2.3 不同形态华根霉Western Blot分析

3.2.4 不同培养条件下华根霉脂肪酶Western Blot分析

3.3 发酵罐水平华根霉脂肪酶发酵调控的研究

3.3.1 支撑网桶设计

3.3.2 通气量对发酵罐水平华根霉脂肪酶合成活性的影响

3.3.3 搅拌转速对发酵罐水平华根霉脂肪酶合成活性的影响

3.4 华根霉膜结合脂肪酶非水相催化短链脂肪酸乙酯的合成

3.4.1 外部脱水-无溶剂体系与有机相催化不同链长脂肪酸酯合成反应的研究

3.4.2 酶加量对RCL催化合成己酸乙酯的影响

3.4.3 摇床转速对RCL催化合成己酸乙酯的影响

3.4.4 反应温度对RCL催化合成己酸乙酯的影响

主要结论和展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士期间发表的文章