孕期低蛋白饮食对子代大鼠骨骼肌葡萄糖代谢的影响及其表观遗传机制探讨

摘要

研究背景
　　胎儿生长受限(fetalgrowthrestriction，FGR)包括宫内生长迟缓(intrauterinegrowthretardation，IUGR)和低出生体重(lowbirthweight，LBW)，是造成围产儿死亡和发病的重要原因之一。代谢综合征（metabolicsyndrome，MS）是以中心性肥胖、糖尿病或糖调节受损、高血压、血脂异常等多种代谢性疾病合并出现为临床特点的一组症候群。目前流行病学和临床研究已在不同国家、不同种族人群中证实了低出生体重是成年后发生MS的高危因素[1]。因而研究低出生体重引起成年后MS的机制，以及实施成年期疾病的早期防治已成为一个研究热点。出于医学伦理学的考虑，不能直接在人体上进行试验，因此必须建立合适的低出生体重动物模型用于实验研究。胎源假说、营养程序化和代谢程序化等理论的提出为孕期低蛋白饮食法建立低出生体重大鼠模型提供了理论基础。
　　胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)是MS发生的共同病理生理机制。骨骼肌是胰岛素发挥生物效应的重要外周组织之一[2]。胰岛素发挥代谢调节作用必须通过胰岛素受体底物蛋白激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3kinase，PI3K)途径。最终通过葡萄糖在骨骼肌细胞转运，增加葡萄糖的摄取，而葡萄糖转运蛋白4(glucosetransporter，GLUT4)是葡萄糖转运蛋白家族的重要成员之一，位于胰岛素信号传递途径的最下游，胰岛素刺激后GLUT4由细胞浆向细胞膜的移位过程是胰岛素诱导的外周组织摄取葡萄糖的限速步骤，与胰岛素抵抗密切相关，GLUT4的表达或活性降低以及调控中任何环节出现异常都将引起胰岛素信号传导减弱或受阻，导致胰岛素抵抗形成，影响其调节糖代谢等生理效应的发挥[3]。过氧化物酶增殖激活受体-共激活子-1α(peroxisomeproliferators-activatedreceptorγcoactivator1，PGClα)为核编码转录共激活子，是调节氧化磷酸化的关键代谢因子，可协同激活多种因子，广泛调节能量的生成与利用，诱导GLUT4基因表达，在转录水平上激活糖异生关键酶组，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶，从而影响血糖代谢[4]。
　　表观遗传学(epigenetics)是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等[5]。已经有研究证实，DNA甲基化可能参与了IUGR发展为T2DM的进程[6]，对T2DM相关基因的表观遗传学调控进行研究可能是控制IUGR发展为MS的途径之一。最近，关于基因表观遗传的研究显示某些关键基因启动子区域CpG岛甲基化状态与代谢程序化密切相关。Lillycrop等[7]研究表明给予孕期大鼠蛋白限制(PR)饮食将使子代肝脏糖皮质激素受体(GR)和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）分子启动子低甲基化从而使得它们的基因表达增加。这些研究充分说明了出生之前的营养状态可通过表观遗传的改变进而对子代表型产生深远的影响。
　　基于IUGR作为2型糖尿病的重要危险因素，我们采用给予孕鼠低蛋白饮食成功制造子代IUGR模型。为了避免性别和激素的混杂因素，我们仅仅选取雌性子代作为研究对象，观察IUGR大鼠自幼年至成年期体重、血糖、血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数等的变化以评估机体水平胰岛素抵抗;观察老年IUGR大鼠骨骼肌葡萄糖摄取以及葡萄糖代谢相关基因表达以评估骨骼肌组织水平胰岛素抵抗;进一步根据基因表达结果分析筛选出候选基因分析其启动子区域甲基化的状态，深入探讨IUGR子代代谢表型改变的原因和机制。
　　目的
　　1)本实验给予孕鼠孕期全程低蛋白（10％蛋白）饮食，观察所生仔鼠数目、平均体重、IUGR发生率及围产期死亡率，检验该方法是否能用于制造宫内发育迟缓(IUGR)模型。
　　2)分析低出生体重大鼠生后自幼年期、成年期直至老年期生长发育的规律以及空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMA-IRI)以及葡萄糖负荷下的胰岛素释放能力的变化，评估IUGR大鼠发生机体水平胰岛素抵抗的状态。
　　3)在低出生体重大鼠模型上观察老年期IUGR大鼠骨骼肌在胰岛素刺激下的葡萄糖摄取情况以评估IUGR大鼠骨骼肌发生组织水平胰岛素抵抗的状态。
　　4)分析老年雌性IUGR大鼠骨骼肌组织中胰岛素信号传导途径中重要分子IR、IRS-1、GLUT4和调节葡萄糖代谢的重要转录因子PGClα的mRNA和蛋白表达情况，探讨IUGR个体发生胰岛素抵抗的分子机制。
　　5)分析老年雌性IUGR大鼠骨骼肌标本给予胰岛素刺激前后，骨骼肌总GLUT4蛋白和细胞膜GLUT4蛋白的表达情况以评估胰岛素刺激下GLUT4的转位情况。
　　6)分析老年雌性IUGR大鼠骨骼肌葡萄糖代谢关键基因——GLUT4和PGClα启动子区域甲基化的状态，研究GLUT4和PGClα表达异常的机制，深入探讨IUGR子代代谢表型改变的原因和机制，进一步为宫内发育迟缓相关代谢病的防治提供理论依据。
　　方法
　　1)低出生体重大鼠模型的建立和实验分组:分别选取健康3m龄Sprague-Dawley(SD)雌性和雄性大鼠18只和6只。按照雌雄3∶1的比例同一笼中交配，次日清晨检测出阴栓者定为受孕成功，进入实验分组。受孕成功的孕鼠随机分为对照组和低蛋白饮食组。对照组母鼠自受孕后第1d开始给予21％正常蛋白饮食，而低蛋白饮食组母鼠自受孕后第1d开始给予10％蛋白饮食。以对照组活仔鼠平均出生体重减去2个标准差作为IUGR的诊断标准，根据出生体重将大鼠分为对照组(CON)和宫内发育迟缓组(IUGR)，为避免性别和激素的影响，本研究只选取雌性大鼠做为研究对象。两组大鼠从出生至21日的哺乳期内，均给予母鼠21％正常蛋白饮食喂养并自由饮水。出生21d后将母鼠、仔鼠分笼，后继续给两组大鼠21％正常蛋白饮食喂养自由饮水，喂养至18m。
　　2)两组大鼠每周称量体重，并选择3w（幼年期）、8w（青春期）、6m（成年期）和18m（老年期）作为观察的4个时间点，每个时间点每组6只大鼠，测量大鼠体重、取血和骨骼肌标本。测定空腹血糖、血清胰岛素值，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IRI）。
　　3)选取18m龄老年雌性大鼠行腹腔内注射葡萄糖糖耐量试验(IGTT)试验并分别计算血糖和血胰岛素在IGTT实验中曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)，以评估IUGR大鼠发生机体水平胰岛素抵抗的状态。
　　4)选取18m龄老年雌性大鼠骨骼肌标本分别放入含/不含胰岛素的KHB缓冲液中孵育后，检测2-D-3H葡萄糖的摄取以评估IUGR大鼠骨骼肌发生组织水平胰岛素抵抗的状态。
　　5)提取18m龄老年雌性大鼠骨骼肌组织mRNA，采用实时荧光RT-PCR方法检测胰岛素信号传导途径中重要分子IR、IRS-1、GLUT4和调节葡萄糖代谢的重要转录因子PGClα的mRNA表达;同时提取总蛋白，用WesternBlot方法检测相关基因的蛋白表达。
　　6)选取18m龄老年雌性大鼠骨骼肌标本给予胰岛素刺激前后，分别提取骨骼肌总蛋白和细胞膜蛋白，用WesternBlot方法分别检测总GLUT4和细胞膜GLUT4的蛋白表达以评估胰岛素刺激下GLUT4的转位情况。
　　7)提取18m龄老年雌性大鼠骨骼肌组织DNA，采用BSP法检测骨骼肌GLUT4和PGC-1α启动子区域的甲基化状态。
　　8)采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析。计量资料两组间均数比较采用t检验，计数资料两样本比较用卡方检验。以P＜0.05为差异具有显著性。
　　结果
　　1)孕期全程低蛋白饮食造模孕鼠的仔鼠平均出生体重明显低于对照组(P＜0.001)，61.11％达IUGR标准，而每窝产仔数和围生期死亡率无明显差异(P=0.743和P=0.580)。
　　2)两组大鼠生长动态比较:与对照组相比,0d、1w、2w和3w龄IUGR大鼠体重明显降低(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001和P=0.019)，4w和8w龄时，两组比较无明显差异(P=0.314和P=0.663);到12w、6m和18m龄时，IUGR大鼠体重明显高于对照组(P＜0.001，P=0.039和P=0.012)。
　　3)两组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数(HOMA-IRI)比较:在3w、8w和6m龄时，对照组和IUGR大鼠血糖均无显著差异(P＝0.668，P=0.323和P=0.211)，而18m龄时，IUGR大鼠血糖较对照组高，但尚无统计学意义（P=0.122）;在3w、8w和6m龄时，对照组与IUGR大鼠血清胰岛素值无明显差异(P＝0.635，P=0.194和P=0.205)，而18m龄时，IUGR大鼠血清胰岛素值较对照组显著增高（P=0.042）;在3w、8w和6m龄时，对照组与IUGR大鼠HOMA-IRI无明显差异（P=0.860，P=0.143和P=0.254），而18m龄时，IUGR大鼠HOMA-IRI较对照组显著增高(P＝0.048)。
　　4)两组大鼠血糖和血胰岛素在IGTT实验中的比较:腹腔下葡萄糖耐量（2g葡萄糖/公斤体重）实验中，18m龄IUGR大鼠空腹血糖和胰岛素均轻微高于对照组大鼠但无统计学差异(P=0.296和P=0.104)，但在葡萄糖负荷后，IUGR大鼠在15min、30min和60min三个时间点的血糖和血胰岛素均明显高于对照组（P＜0.05），并导致相应的血糖和血胰岛素曲线下面积(AUC)均高于对照组(P＜0.05)。
　　5)两组18m龄大鼠骨骼肌胰岛素刺激下葡萄糖摄取比较:与对照组相比，18m龄IUGR大鼠骨骼肌的基础葡萄糖摄取率较正常同龄大鼠略低（P＝0.149）;在接受了2IU/L胰岛素刺激30min后，IUGR大鼠的葡萄糖摄取率较对照均显著降低(P=0.035)，提示IUGR大鼠骨骼肌组织存在胰岛素抵抗。
　　6)两组18m龄大鼠骨骼肌中IR、IRS-1、GLUT4和PGC1αmRNA的相对含量比较:IR和IRS-1mRNA表达在对照组和IUGR大鼠骨骼肌中无显著性差异(P=0.259和P=0.227);而GLUT4和PGC1α表达在IUGR大鼠骨骼肌中较对照组显著下降(P=0.031和P=0.042)。
　　7)两组18m龄大鼠骨骼肌中IR、IRS-1和PGC1α蛋白表达比较:IR和IRS-1蛋白表达在对照组和IUGR大鼠骨骼肌中无显著性差异(P=0.525和P=0.075);而PGC1α表达在IUGR大鼠骨骼肌中显著下降(P=0.023)。
　　8)两组18m龄大鼠胰岛素刺激前后骨骼肌GLUT4总蛋白和膜蛋白表达比较:①基础状态时，与对照组相比，IUGR组GLUT4总蛋白表达均无明显差异(P=0.967);IUGR组GLUT4膜蛋白表达略降低，但未及统计学意义(P=0.072);②经胰岛素刺激后，对照组和IUGR大鼠与各自基础状态相比，GLUT4总蛋白变化不明显，GLUT4膜蛋白表达均较各自的基础状态显著增加，但IUGR大鼠骨骼肌GLUT4膜蛋白的上升程度显著低于对照组低(P=0.001)。
　　9)两组18m龄大鼠骨骼肌GLUT4基因启动子区CpG位点甲基化呈散在分布，无显著性差异（P＞0.05）
　　10)两组18m龄大鼠骨骼肌PGC1α基因启动子区CpG位点甲基化率显著高于对照组大鼠相应的甲基化率（16.18％vs9.31％，X2=4.879，P＜0.05）
　　结论
　　1)孕期全程10％低蛋白饮食法成功建立IUGR大鼠模型，制模可靠，效果比较理想。
　　2)IUGR大鼠生长发育规律:IUGR大鼠出生时体态瘦小，后出现“追赶生长”，体重与正常鼠无明显差异，但经过青春期后，成年鼠直至老年鼠均较同龄正常大鼠肥胖。
　　3)6m龄内IUGR大鼠尚未出现空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数的异常，但18m龄IUGR大鼠出现血清胰岛素和胰岛素抵抗指数升高，且IGTT葡萄糖负荷下血糖AUC和胰岛素AUC增加，呈现外周胰岛素抵抗并具有发生MS的倾向表现。
　　4)与同龄对照组大鼠相比，18m龄IUGR大鼠骨骼肌葡萄糖摄取下降、GLUT4mRNA降低以及PGC1αmRNA和蛋白表达降低。
　　5)与同龄对照组大鼠相比，18m龄IUGR大鼠骨骼肌基础状态下GLUT4总蛋白和膜蛋白无显著差异;但胰岛素刺激后IUGR大鼠骨骼肌中GLUT4向细胞膜转位减少。
　　6)与同龄对照组大鼠相比，18m龄IUGR大鼠骨骼肌GLUT4基因启动子区CpG位点甲基化呈散在分布，无显著性差异;PGC1α基因启动子区CpG位点甲基化率显著高于对照组大鼠相应的甲基化率，表明低出生体重大鼠成年发生胰岛素抵抗可能与关键基因的甲基化异常相关。

目录

声明

摘要

缩略词表

表观遗传学在宫内发育迟缓研究中的进展

第一部分 宫内发育迟缓大鼠模型的建立及成年后胰岛素抵抗

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 宫内发育迟缓大鼠骨骼肌葡萄糖代谢途径分子水平的变化

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 宫内发育迟缓大鼠骨骼肌葡萄糖代谢相关分子的调控机制探讨

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

结论与展望

参考文献

作者简介

致谢