基于一个肝癌相关长链非编码RNA基因的克隆及序列分析研究

摘要

我们在生物学研究过程中，经常需要进行序列同源性分析，就为了确定新测序列的生物属性，主要方法就是将新序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其他序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步，完成这一工作通常使用序列比对的方法。
　　本文中我们利用新一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者活检标本及正常对照肝组织样品进行高通量RNA测序(RNA-Sequencing，RNA-Seq)，在肝癌样品中染色体11q13.1区域检测到几个相邻的RNA-Seq信号峰，而在正常对照组织中没有检测到，且该染色体区域目前尚无已知基因登录，提示这几个RNA-Seq峰可能代表一个或多个未知的新基因.我们以此为线索，证实这几个RNA-Seq峰来自同一个新基因，并克隆了该基因全长序列，在克隆该基因全长序列时，我们发现该基因编码的RNA存在多种剪接形式，最长的转录本为3562 bp.我们将该基因编码的12条代表性RNA转录本序列递交到美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank数据库中，GenBank ID号分别为KC136297～KC136308.该基因编码的RNA没有发现明显的开放阅读框(open reading fragment，ORF)，提示该基因可能编码长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA).为了探讨该lncRNA基因可能的转录调控机制，我们用生物信息学方法预测了该lncRNA基因潜在启动子区域，发现在其转录起始位点上游-719～-469 bp处有一个潜在的启动子，其中包含7个Sp1、1个STAT5和1个EGR1转录因子结合位点.该lncRNA在肝细胞癌发生发展过程中的作用机制值得进一步深入研究.

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 研究背景概述

1．1．1 生物信息学背景

1．1．2 医学背景

1．1．3 分子生物学背景

1．2 国内外研究现状

1．2．1 新一代测序技术

1．2．2 长链非编码RNA

1．2．3 肝癌相关基因

1．3 论文研究的目的和意义

1．3．1 目的

1．3．2 意义

1．4 论文研究内容与组织结构

1．4．1 研究内容

1．4．2 组织结构

2 论文研究方法

2．1 论文研究步骤

2．1．1 RNA-Seq测序峰序列组装和校对

2．1．2 RT-PCR研究11q13．1区域多个RNA-Seq峰是否转录自同一个基因

2．1．3 GeneRacerTM克隆RNA全长序列

2．1．4 新克隆的基因序列分析及生物信息学预测

2．2 论文应用平台

2．2．1 新一代测序平台

2．2．2 临床样品

2．2．3 试剂及试剂盒

2．2．4 仪器

2．2．5 应用的软件

2．3 新一代测序技术的应用

2．4 小结

3 长链非编码RNA在序列比对中的应用

3．1 RNA-Seq在染色体11q13．1区域发现多个相邻的RNA信号峰

3．2 RT-PCR证实11q13．1区域多个RNA-Seq峰转录自同一个基因

3．3 GeneRacerTM克隆RNA全长序列

3．4 新克隆的基因有多个转录本且没有明显的开放阅读框

3．5 新克隆的lncRNA在ENCODE数据库中没有发现同源基因

3．6 新克隆的lncRNA进化保守性分析

3．7 新克隆的lncRNA二级结构预测

3．8 新克隆的lncRNA启动子预测和转录结合位点分析

3．9 小结

4 课题总结及研究展望

4．1 课题讨论及总结

4．2 课题研究展望

参考文献

获得硕士学位期间发表的论文

致谢