结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变株体外最小抑菌浓度的研究

摘要

目的：探讨结核分枝杆菌耐利福平、异烟肼临床分离株 rpoB、katG和 inhA基因不同突变位点对体外最小抑菌浓度（MIC）的影响，以期为临床用药提供参考；将实验菌株进行利福平与异烟肼相关耐药基因芯片检测，并与常规药敏进行比较分析评价芯片检测技术的临床应用价值。
　　方法：利用芯片检测技术收集长沙市中心医院2014年1月1日～2015年12月30日结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变菌株和野生型菌株，采用罗氏培养法进行菌种复苏，并进行不同浓度利福平和异烟肼药敏试验，观察不同基因突变类型的菌株引起利福平和异烟肼 MIC值的变化并比较分析基因芯片法与传统药敏法的一致性。
　　结果：实验中利福平rpoB基因突变株71株，野生型58株，异烟肼katG和inhA基因突变株66株，野生型32株。
　　1.利福平 rpoB基因突变株 MIC值测定中，野生型58株 MIC值为8.84±10.3μg/ml，ropB基因突变菌株中531（C→T）为20株， MIC值为576.0±131.3μg/ml，526（C→G/T）为18株，MIC值为355.5±252.6μg/ml，516（ A→G/T）为17株， MIC值为432.9±157.6μg/ml；野生型的MIC显著低于三个突变组（p=0.00<0.05），差异有统计学意义，其他单位点、双位点及三位点突变株 MIC值均较高；突变菌株中531（C→T）MIC值与526（C→G/T）、516（A→G/T）比较差异显著（分别为 p=0.016<0.05和 p=0.033<0.05），而526（C→G/T）和516（A→G/T）之间差异没有统计学意义（p=0.849>0.05）。
　　2.69株利福平比例法耐药株中有68例芯片法rpoB基因突变，灵敏度为98.6%，60株利福平比例法敏感株中有57例芯片法为野生型，特异性95.0%；基因芯片检测耐 RFP基因时(χ2=0.062， P=0.803>0.05)，基因芯片法和传统药敏比例法比较没有显著性差异。
　　3.异烟肼katG和inhA基因突变株MIC值测定中，32株野生型的MIC值为0.06±0.05μg/ml，20株inhA-15（C→T）突变菌株MIC值为0.37±0.09μg/ml，46株 KatG315(G→C/A)突变株 MIC值为5.76±4.06μg/ml；野生型的MIC显著低于两个突变组（均p<0.05），差异有统计学意义，突变株中 inhA-15（C→T）与315（G→C/A）比较差异显著（p=0.00<0.05）。
　　4.68株异烟肼比例法耐药株中65例基因芯片法基因突变，灵敏度95.6%，30例比例法异烟肼敏感株中29例芯片法为野生型，特异性96.7%；基因芯片法检测耐 INH基因时,（χ2=0.094， P=0.759>0.05），基因芯片法和传统药敏比例法比较没有显著性差异。
　　结论：1.耐药基因突变位点存在地区差异性，长沙市中心医院分离耐 RFP菌株以 rpoB基因531位点突变为主，耐 INH菌株以KatG315和inhA-15位点突变为主。
　　2. RFP和INH相关耐药基因rpoB、katG和inhA存在多种突变模式，不同的突变模式在耐药表型上存在差异。
　　3.基因芯片法有高度的灵敏度和特异性，芯片法可以代替传统药敏法快速筛查结核分枝杆菌的耐药性。

目录

声明

英文缩略词

第1章 绪论

第2章 结核分枝杆菌的分离培养

2.1实验原理

2.2研究对象

2.3研究内容

2.4材料

2.5实验步骤

2.6注意事项

2.7质量控制

第3章 耐药菌株的筛选—基因芯片法

3.1实验原理

3.2研究对象

3.3主要仪器和试剂

3.4操作步骤

3.5注意事项

3.6质量控制

3.7探针分布

3.8基因芯片的结果判读

第4章 不同基因突变位点菌株与药物不同浓度药敏实验

4.1实验原理

4.2研究对象

4.3实验内容

第5章 结果

5.1基因芯片检测结果

5.2 RFP

5.3 INH

第6章讨论

第7章结论

参考文献

综述：结核分枝杆菌对常见的一线和二线药物耐药机制的研究进展

攻读学位期间研究成果

致谢