农业废物堆肥中微生物总DNA提取方法的研究及其应用

摘要

堆肥是利用自然界中广泛存在的微生物，在人工控制的条件下，将可生物降解的有机物转化为肥料的过程。然而，可培养微生物仅占自然界微生物的0.1％～10％，不能很好地反映自然环境中微生物多样性的原始状态。随着分子生物学和系统发育分析方法的发展，基于16S rDNA基因的分子生物学方法逐渐被用来分析复杂的生态系统。本文对农业废物垃圾进行堆肥处理，并采用聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction—Denature Gradient GelElectrophoresis，PCR—DGGE)技术对堆肥过程中微生物群落与木质纤维素降解的关系进行了研究。 首先在固态发酵培养条件下，研究了用于其微生物群落多样性及演替情况分析的微生物基因组提取方法。对比3种(溶壁酶法，超声波法，液氮研磨+CTAB法)可同时从固态发酵中提取细菌和真菌DNA的方法。使用紫外分光光度计测定DNA产量与纯度；使用细菌16s rDNA基因通用引物(341F和907R)和真菌18S rDNA基因通用引物(NU—SSU—0817和NU—SSU—119)对DNA进行PCR扩增；采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)法对纯化后的PCR产物进行多样性分析。结果显示，三种方法得到的粗提和纯化DNA长度都约为23kb；细菌和真菌PCR产物长度分别约为586bp和422bp；DGGE分析表明3种方法提取的DNA反映的微生物多样性比较一致；但通过紫外分光光度计的测定表明：溶壁酶法提取固态发酵中微生物总DNA产量最高，超声波法次之，液氮研磨+CTAB法最差。所以综合以上各结果，溶壁酶法最优。 采用筛选到的最佳提取DNA方法，从农业废物垃圾好氧堆肥样品中提取出堆肥混合菌群的总DNA，粗提DNA经过纯化后，采用GC—341F/907R引物进行PCR扩增16SrDNA基因段，用DGGE进行分离和鉴定PCR扩增产物，从而得出农业废物垃圾堆肥过程中微生物种群多样性的信息。DGGE图谱显示，堆肥初期有较多的微生物多样性，随着堆肥温度的升高，一些中温期的微生物被淘汰，高温期微生物多样性减少，同时噬热菌出现，并成为优势菌群。高温期过后，微生物多样性进一步锐减。从而表明堆肥的温度是影响堆体中微生物生长的重要因素，不同的温度，堆体具有适应这个温度的不同的优势菌种。同时，对几种特征堆肥参数进行了测定，结果显示，经过39d的堆肥，堆肥产物基本达到要求。而通过对木质纤维素降解以及各酶活(Lac、LiP、MnP)的测定，可以发现在微生物种群数增加阶段，纤维素、半纤维素降解速度和酶活量都有增加。而在微生物数递减阶段，木质纤维素的降解速度有所缓慢且酶活量有下降趋势。从而看出，微生物的种群数和木质纤维素的降解有一定的相关关系。从以上研究表明，将溶壁酶法用于研究堆肥过程中菌落的多样性、演替情况以及群落与生物降解关系是可行的。此研究对于堆肥菌剂的开发提供了很有意义的方法借鉴，有助于解决在菌剂开发中选择菌株缺乏依据的问题，还可以为其他环境体系的菌落研究提供参考。

目录

文摘

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论文说明：图表索引

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第1章 绪论

1.1 堆肥概述

1.2 堆肥化过程中难降解的木质纤维素

1.2.1 纤维素的结构及生物降解

1.2.2木质素的结构及生物降解

1.3 堆肥化过程中的微生物研究

1.3.1 堆肥化过程中微生物群落的演替

1.3.2影响堆肥化中微生物活动的因素

1.4非培养生物方法研究微生物群落演替

1.4.1 分子生物学法

1.4.2 Biolog代谢分析法

1.4.3生物标志物方法

1.4.4组合应用

1.5 本研究的主要内容

第2章 固态发酵中微生物总DNA提取方法的比较

2.1 固态发酵

2.1.1 固态发酵技术

2.1.2 固态发酵工艺研究

2.1.3 固态发酵技术生产的产品

2.2实验材料

2.2.1原材料

2.2.2实验药品、仪器和设备及操作

2.2.3 实验设计

2.3 实验步骤

2.3.1 样品来源

2.3.2样品的前处理

2.3.3研究方法

2.4 结果

2.4.1 细胞裂解效率

2.4.2不同方法得到的粗提DNA产量

2.4.3 DNA的纯化效率

2.4.4 PCR产物

2.4.5 DGGE分析

2.5 结论

第3章 堆肥过程中微生物群落结构与木质纤维素降解的研究

3.1 PCR-DGGE在堆肥中的研究进展

3.1.1 DGGE用于堆肥过程中微生物菌群演替规律的研究

3.1.2 DGGE用于纤维素降解菌系的研究

3.2实验材料与方法

3.2.1 堆肥原材料和堆肥方法

3.2.2实验药品及仪器

3.2.3参数测定

3.2.4溶液的配制

3.3结果与讨论

3.3.1 堆肥过程中含水率的变化

3.3.2堆肥过程中温度的变化

3.3.3 堆肥过程中pH的变化

3.3.4堆肥过程中C/N的变化

3.3.5 堆肥过程中各酶活的变化

3.3.6堆肥过程中木质纤维素的变化

3.3.7变性梯度凝胶电泳

3.4 小结

第4章 结论

参考文献

致谢

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