功能核酸用于环境及活细胞内金属离子的传感与成像研究

摘要

金属元素在整个生命体系中有双重作用，一方面能维持动植物的生命活动，另一方面也可能危害其健康。因此，研究环境中及生物体内的金属离子含量与分布，并对其进行有效地检测，对于保护环境与人类健康有积极意义。功能核酸是指具有特定生物功能，一般指能高特异性结合特定目标物或具有某些催化功能的核酸分子。功能核酸探针在传感方面具有一些独特的优势:功能核酸可以通过指数富集配体系统进化法(SELEX)筛选获得，理论上任何目标物均可筛到其对应的功能核酸;已经筛到的功能核酸可以通过合成获得，适用于大批量生产;一些功能核酸，如左旋核酸(L-DNA)在生理环境下更稳定，抗酶切降解效果更好，为活体金属离子检测提供了可行性;最后，功能核酸可以经历多次变性复性而不改变其活性，更易保存，减少了设备消耗。更重要的是，一些功能核酸对金属离子表现出高度特异性，且响应信号与金属离子含量相关，这为简单、方便、有效地检测金属离子提供了可能性。因此，利用功能核酸的优点，我们设计了一系列的生物传感器用于检测环境和生物体内金属离子。
　　在第二章中，我们构建了一种基于钾离子传感寡核苷酸(Potassium SensingOligonucleotide，简称PSO)的生物传感器。首先用修饰有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，简称FRET)报告基团对的DNA链来优化PSO的终端，以获取更高的灵敏度，然后用DNA合成仪将二酰基脂质组装到PSO链上。在有钾离子出现时，形成的G-四聚体构型会使产生FRET效应的两种荧光基团(FAM和TAMRA)对靠近，从而导致FRET效率发生改变。此外，随着K+浓度的变化，荧光强度比率也是可逆的。基于这个实验方案，我们在细胞膜上组装了该传感器，并第一次将其用于实时检测细胞微环境中K+浓度的动态变化。
　　在第三章中，我们构造了一种在均相溶液和活性细胞中的L型凝血酶结合适配体（L-type Thrombin Binding Aptame，简称L-TBA）K+传感器，通过用可预测的L-TBA的优点，演示基于L-TBA的K+传感器克服了天然D-PSO的缺陷，从而在活性细胞内实现K+成像并且表现出精确，安全和生物正交PSO的优点。
　　在第四章中，我们基于Pb2+ DNAzymes，采用已报到的D-DNAzyme序列，根据L-DNAzyme与D-DNAzyme在存在非手性金属离子辅因子时有类似的催化活性，但在生物样品中，L-DNAzyme还有额外的生物稳定性的优点，设计了L-DNAzyme识别单元的生物传感器并将其用在环境水体检测，如湘江水，和复杂生物环境中，如胎牛血清（Fetal bovine serum，简称FBS），来检测pb2+。目前，已筛选出的特异性识别各种离子的DNAzymes，很可能为针对灵敏性和选择性而发展的检测各种目标物的新的基于L-DNAzyme的传感系统在生物医学和环境检测领域提供更深一步的应用。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 金属离子在生物体内的作用

1．2 目前检测金属离子的方法

1．3 功能核酸在检测金属离子中的应用

1．3．1 功能核酸

1．3．2 功能核酸种类

1．3．3 基于功能核酸的金属离子传感器

1．4 本论文的研究工作

第2章 固定在细胞膜上动态检测细胞微环境中钾离子的生物传感器

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 DNA合成

2．2．3 荧光检测

2．2．4 细胞培养

2．2．5 流式分析

2．2．6 共聚焦成像

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验条件优化

2．3．2 圆二色谱表征分析

2．3．3 荧光检测

2．3．4 流式分析与共聚焦

2．4 小结

第3章 生物稳定性的的L型G-四聚体用于细胞内钾离子传感

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 材料和试剂

3．2．2 DNA合成

3．2．3 荧光检测

3．2．4 凝胶电泳

3．2．5 细胞培养

3．2．6 共聚焦成像

3．2．7 流式分析

3．2．8 细胞毒性研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 圆二色谱表征分析

3．3．2 L-TBA探针在溶液中对K+的检测分析

3．3．3 L-TBA的稳定性分析

3．3．4 L-TBA的毒性分析

3．3．5 L-TBA对细胞内K+成像分析

3．4 小结

第4章 生物稳定性的L-DNAzyme用于复杂实际样品中铅离子的检测

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 DNA合成

4．2．3 荧光检测

4．2．4 凝胶电泳

4．3 结果与讨论

4．3．1 实验原理

4．3．2 圆二色谱表征及对映体酶链的热动力学研究

4．3．3 对映体酶的催化活性

4．3．4 对映体酶的生物稳定性

4．3．5 L-DNAzymes在实际样品中的性能

4．4 小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢