重组蝎氯毒素靶向抗神经胶质瘤及其肿瘤诊断研究

摘要

神经胶质瘤是一种起源于胶质细胞的原发性颅内肿瘤，是中枢神经系统最常见而又最难诊治的恶性肿瘤，致死率高，患者平均存活时间不到一年。近年来恶性胶质瘤的发病率也不断上升，是当前34岁以下肿瘤患者的第二位死亡原因。胶质瘤难于诊治的原因主要是因为其具有高度的浸润和转移性，增殖速度快，早期边界不明显，缺乏有效的诊断、治疗方法。研究发现，胶质瘤细胞与其它肿瘤不同之处在于它表达一种特殊的氯离子通道电流，其恶性程度与氯离子通道电流呈正相关。天然有毒动物毒液中富含有数量众多的离子通道电流抑制多肽。据此在蝎毒液中发现了对胶质瘤具有重要治疗和诊断价值的一类毒素多肽:蝎氯毒素。与此同时，基于纳米荧光材料的荧光探针检测技术越来越受到人们的重视，成为物理学、化学、生命科学与医学的重要交叉研究领域。利用蝎氯毒素的胶质瘤细胞靶向性和纳米材料的荧光特性，开展蝎氯毒素-纳米荧光复合物靶向抗神经胶质瘤及其诊断研究有重要的意义。 本文首先根据蝎氯毒素CTX多肽的一级结构序列，采用overlapping PCR方法，获得了N端连着小肠激酶酶切位点编码序列的CTX基因片段，选用原核表达载体pGEX-6p-1，构建了重组表达载体pGEX-6p-1-CTX，转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达GST-CTX融合蛋白(gCTX)。重组表达的融合蛋白经GSH亲和层析胶纯化，超滤离心脱盐浓缩后，用小肠激酶进行酶切，通过HPLC分离纯化获得重组CTX多肽，约1.5mg/L培养物，纯度大于95％以上。经质谱鉴定，重组CTX多肽的分子量大小为3998.03Da，考虑到CTX形成的4对二硫键所带来分子量8Da的减少，检测结果与理论分子量3997.58Da完全一致。建立了重组表达蝎氯毒素多肽CTX的技术体系，获得了高纯度的重组蝎氯毒素多肽CTX。 将稀土上转换荧光纳米微粒进行氨基化表面修饰，再与重组蝎氯毒素CTX多肽偶联，制备了蝎毒素CTX-稀土荧光纳米探针(CTX∶UCNPs)。检测了CTX∶UCNPs复合物的荧光强度、荧光稳定性、细胞毒性等探针性能。在动物水平上采用上转换活体成像系统，完成了对小鼠皮下异殖神经胶质瘤的靶向标记与可视化检测，系统研究了蝎氯毒素-稀土纳米探针体外细胞和体内活体肿瘤的靶向标记。实验结果表明，应用所合成的蝎毒素CTX-稀土荧光纳米探针，可实现活体肿瘤在近红外照射下的可视化检测与荧光成像。 另外，采用同样的方法重组表达了蝎氯毒素gCTX融合蛋白，并建立了神经胶质瘤大鼠荷瘤模型，以此开展了重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白体内靶向抑制神经胶质瘤增殖和转移的实验。结果显示，给药17后的大鼠肿瘤体积和重量都明显小于对照组，对神经胶质瘤的生长抑制率达到85.45±3.41％。给药27后解剖动物，发现重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白对神经胶质瘤的转移抑制率达到50％。将131I和Cy5.5分别螯合于重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白，计算动物各组织相应的％ID/g变化和观察近红外光激发后gCTX-Cy5.5螯合物在肿瘤组织中是否产生明显的受激荧光，试验结果发现重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白对神经胶质瘤有特异的靶向性。 基于重组gCTX融合蛋白具有特异靶向抗神经胶质瘤增殖与转移功能，以其为模版，合成了具有靶向神经胶质瘤，且能够激发可见近红外荧光的蝎氯毒素-金纳米簇复合物(Au@(gCTX)NCs)，系统检测了该Au@(gCTX)NCs复合物的荧光强度、荧光稳定性、细胞毒性等探针性能，在细胞水平上并对其靶向抑制神经胶质瘤的生长与转移进行了初步研究。结果显示，蝎氯毒素-金纳米簇Au@(gCTX)NCs复合物能够特异靶向神经胶质瘤细胞，并能在体外抑制神经胶质瘤细胞的生长，其生长抑制率为42.23±1.51％。同时也能够有效抑制金属基质蛋白酶2(MMP-2)的活性，其抑制率为60.34±0.05％。因此，合成的蝎氯毒素-金纳米簇Au@(gCTX)NCs复合物具有靶向抗神经胶质瘤的作用。 本论文结合蝎氯毒素对胶质瘤的高特异靶向功能和纳米微粒独特的生物荧光特性，设计与制备了2种蝎氯毒素-纳米荧光复合物，且这2种蝎氯毒素-纳米荧光复合物在体内外具有靶向抗神经胶质瘤功能，显示了在神经胶质瘤的诊断与治疗方面可能有潜在的价值。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1蝎的种类

1．2蝎毒素的组成和分类

1．3蝎毒素的功能

2蝎氯毒素的发现、结构与功能

2．1蝎氯毒素的发现与来源

2．2 蝎氯毒素的分子生物学特征

2．3蝎氯毒素结构与功能的关系

3．神经胶质瘤

3．1神经胶质瘤的起源

3．2神经胶质瘤的危害

3．3神经胶质瘤的生物学特点

3．4神经胶质瘤与蝎氯毒素

4多肽在分子成像和医学诊断中的应用

4．1基于多肽的成像探针的设计

4．2多肽探针的成像应用模式

5本论文的目的与意义

第二章重组蝎氯毒素CTX的表达、纯化与鉴定

1．1材料

1．2方法

2实验结果

2．1 CTX表达载体的构建

2．2融合蛋白的表达、纯化和酶切

2．3 CTX多肽的RP-HPLC分离纯化与鉴定

3讨论

第三章蝎氯毒素-稀土纳米探针体内外对神经胶质瘤的靶向性研究

引言

1材料和方法

1．1材料

1．2实验方法

2实验结果

2．2蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的物理性质

2．3蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的体外对神经胶质瘤的靶向性

2．4蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的体内对神经胶质瘤的靶向性

2．5蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs体内外的初步毒性

3讨论

第四章重组蝎氯毒素蛋白靶向抗神经胶质瘤的研究

1．1材料

1．2方法

2结果

2．1重组蝎氯毒素gCTX蛋白的制备与鉴定

2．2重组蝎氯毒素gCTX体内对神经胶质瘤生长的抑制

2．3重组蝎氯毒素gCTX体内对神经胶质瘤转移的抑制

2．4重组蝎氯毒素gCTX对体内神经胶质瘤的靶向性

3讨论

第五章蝎氯毒素-金纳米簇复合物抑制神经胶质瘤细胞生长与转移研究

1材料和方法

1．1材料

1．2方法

2实验结果

2．2蝎氯毒素-金纳米簇复合物的特征与鉴定

2．3蝎氯毒素-金纳米簇复合物对神经胶质瘤细胞的靶向性

2．4蝎氯毒素-金纳米簇复合物体外抑制神经胶质瘤的生长

2．5蝎氯毒素-金纳米簇复合物体外抑制神经胶质瘤的转移

3讨论

研究总结与展望

参考文献

研究生期间已发表和待发表的论文及申请的专利

致谢