蛋白组学研究单核细胞增生李斯特菌Sigma B和PrfA因子在耐受胆汁酸盐胁迫中的作用

摘要

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下简称LM）是一种常见的革兰氏阳性食源性致病菌，属于李斯特菌属，是人畜共患李斯特菌病的主要病原菌。在美国及欧洲等西方发达国家，临床发病率大约为十万分之二到八，死亡率为百分之二十到三十。由于该菌在自然界广泛存在，且能够在高盐(10％NaCl)、长时间干燥及较宽的pH(pH4.5-9.0)和温度(0-45℃)等多种环境中生存，导致食品在加工及运输过程中易受其污染，通过摄入污染的食品引起李斯特菌病的发生。当LM进入人体胃肠道后，首先要耐受胃肠道内复杂的生理生化环境，包括胃酸所导致的低pH环境，肠道中高渗透压及胆囊分泌到肠道中的胆汁酸盐等，然后突破胃肠屏障进入细胞和血循环中，进而侵染肝、脾和脑等内部组织和器官。因此，LM能否耐受胃肠道系统中极端环境的胁迫是其成功侵染宿主细胞的先决条件。目前研究发现，LM对环境的耐受能力以及致病性的高低与如下两种调控因子的作用息息相关: (1)压力调控因子Sigma B(σB)。σB由sigB基因编码，存在于许多低G+C含量的革兰氏阳性致病菌属中。LM通过σB启动与压力胁迫相关基因的表达，以增强其对不利环境的适应。这些基因包括与耐受氧化，以及高或低的渗透压、酸碱、温度和胆汁酸盐等压力胁迫相关的基因。这些相关基因的表达对于LM在千变万化的环境中生存，进而侵入宿主，并在宿主中生存繁殖，最终引起宿主致病等方面起着重要的作用。 (2)毒力基因调控蛋白PrfA。PrfA由prfA基因编码，prfA与hly、plcA、plcB、mpl及actA共同组成LM基因组上一段9kb长的基因簇，即LM毒力岛Ⅰ(LIPI-Ⅰ)，其编码的毒力蛋白在侵染宿主细胞的过程中发挥着至关重要的作用。迄今发现，包括毒力岛Ⅰ在内的大多数毒力基因的转录表达受到PrfA的调控。PrfA通过特异性识别并结合到靶基因启动子转录起始点上游约40bp处的一段14bp长的回纹保守序列(TTAACANNTGTTAA，N代表TCGA中任一碱基)，即所谓的PrfA-box，从而直接调控毒力基因的转录表达。同时，PrfA也通过与其它调节因子的相互作用从而间接参与细菌细胞的各种生理活动。 研究发现，某些毒力基因的的启动子区域同时存在PrfA和σB的结合位点，例如与胆汁盐降解直接相关的bsh（编码胆汁酸盐水解酶）基因。而且，prfA上游的两个启动子中的P2启动子上存在一套完整的σB的保守序列（GTTA-N16-GGGTAT），该启动子的转录严格依赖σB，暗示环境胁迫和毒力基因表达调控之间存在一定关联。 为了探究σB和PrfA因子在LM耐受胆汁酸盐的过程中所起的作用，本文利用高通量的蛋白质组学方法，比较研究了LM野生株EGD、EGD△prfA（PrfA单缺失）、EGO△sigB（Sigma B的单缺失）和EGD△prfA△sigB（PrfA和Sigma B双缺失）四种菌在无胆汁酸盐，以及中(0.3％)和高(3％)浓度胆汁酸盐刺激下总蛋白的差异表达，结果如下: (1)通过比较LM野生菌株EGD与相同浓度胆汁酸盐刺激下sigB基因缺失菌株EGD△sigB总蛋白表达图谱的差异，找出胆汁酸盐刺激条件下受σB因子调控的蛋白差异点6个; (2)通过比较野生菌株EGD与相同浓度胆汁酸盐刺激下prfA基因缺失菌株EGO△prfA总蛋白表达图谱的差异，找出胆汁酸盐刺激条件下受PrfA因子调控的蛋白差异点8个; (3)通过比较野生菌株EGD与双缺失菌株EGD△prfA△sigB在相同浓度胆汁酸盐刺激下总蛋白表达图谱的差异，找出胆汁酸盐刺激条件下受PrfA和σB因子调控的蛋白差异点7个。 本实验对σB因子及PrfA因子在耐受胃肠道胆汁酸盐环境中的作用以及调控机理进行了初步研究，为后续从转录水平上验证σB因子及PrfA因子在相关基因的表达过程中的作用提供了理论依据。

目录

声明

摘要

第一章引言

1．1 Sigma B在环境压力胁迫中的作用

1．1．1细菌生长过程中σB因子的转录表达与活性的关系

1．1．3 σB在耐受渗透压环境中的作用

1．1．4 σB在耐受低温环境中的作用

1．2 PrfA在LM毒力基因表达调控中的作用

1．2．1 PrfA因子的结构

1．2．2 PrfA蛋白调控毒力基因表达的机制

1．3 Sigma B与PrfA的相互作用以及与其他调控因子之间的关系

1．3．1 σB与PrfA的相互作用

1．3．2 LM中与环境胁迫有关的其他调控因子

1．3．3 σB及PrfA与LM中其它调控因子之间的调控网络

1．4 LM蛋白质组学的研究

1．4．1蛋白质组学的概念

1．4．2蛋白质组学主要研究技术

1．4．3 LM蛋白质组学研究进展

1．5结论与展望

第二章单核细胞增生李斯特菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化

2．1 实验材料

2．1．1菌株

2．1．2主要试剂

2．1．3主要仪器设备及软件

2．1．4常用试剂配制

2．2方法

2．2．1菌株及培养液

2．2．2 EGD总蛋白质样品制备

2．2．3蛋白样品浓度测定

2．2．4双向电泳

2．2．5凝胶图像分析和统计学处理

2．3结果

2．3．1 EGD总蛋白制备方法的比较

2．3．2蛋白样品不同上样量的比较

2．4讨论

第三章单核细胞增生李斯特菌耐受肠道胆汁酸盐环境机制的蛋白质组学研究

3．1实验材料

3．1．1菌株

3．1．2主要仪器及软件

3．2方法

3．2．1菌体的培养与收集

3．2．2 LM总蛋白的提取

3．2．3双向电泳

3．2．4差异点分析

3．3结果

3．3．1 EGD在不同浓度胆汁酸盐刺激下总蛋白表达图谱的比较

3．3．2 EGD△sigB在不同浓度胆汁酸盐刺激下总蛋白表达图谱的比较

3．3．3 EGD△prfA在不同浓度胆汁酸盐刺激下的总蛋白表达图谱的比较

3．3．4 EGD△prfA△sigB在不同浓度胆汁酸盐刺激下的总蛋白表达图谱的比较

3．4讨论

3．5小结

参考文献

在校期间发表的论文、科研成果等

致谢