几种分子标记技术的建立及其在部分柿属植物亲缘关系研究中的应用

摘要

柿是柿科柿属植物，我国是柿属植物的分布中心和原产中心之一，拥有丰富的种质资源。但长期以来，对我国柿属植物的种类和分布还缺乏清楚的了解，对我国柿属植物的起源、演化和亲缘关系缺乏深入的探讨。本研究首次开发了柿属植物SSR分子标记技术，并同时采用SSR，SRAP，IRAP和REMAP四种DNA分子标记技术，分别对供试7种柿属植物(柿；君迁子；浙江柿；油柿；金枣柿；老鸦柿；美洲柿)进行了亲缘关系分析，以期从DNA水平上明确柿种间及种下的亲缘关系和分类地位，为柿属植物种质资源的科学利用提供依据。主要结果如下： 1.利用数据库查询的方法开发柿属植物SSR引物。查询GenBank，EMBI。和DDBJ数据库中的柿属植物核酸序列，采用Sputnik筛选包含SSR的序列，用PrimerPrimere 5.0设计SSR引物。从98条核酸序列中共计筛选到SSR引物7对，并建立起柿属植物SSR-PCR扩增技术体系。 2.利用ISSR技术结合抑制PCR技术开发SSR引物。使用ISSR引物8条，对基因组DNA扩增后，设计抑制PCR引物进行染色体步行，共计开发出12对SSR．引物，其中9对表现较好。在GenBank上登录序列19条。 3.采用链亲和素与生物素之间具有很强的亲和能力的原理，用链亲和素磁珠富集法使用生物素标记的探针(GA)<,10>开发柿SSR引物6对，并在GenBank上登录6条。 4.利用自主开发的SSR标记，选用18对SSR引物对柿属植物的亲缘关系进行分析，实验中采用两种电泳方式进行检测。有关等位基因的相关信息从PAGE胶上获得，聚类图构建的数据则来源于琼脂糖凝胶电泳。结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方式共得到158条多态性带，每个引物检测的带数从5到20条不等。6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上检测到的等位位点数的变化从3到24不等，平均每个引物检测到15个位点。PAGE胶上所检测的扩增条带数明显比琼脂糖凝胶上的多。根据琼脂糖凝胶所获得的数据由NTSYS计算30份试材间的相似系数，结果表明供试材料的相似系数变化范围在0.42(浙江柿和老鸦柿)到0.93(富有和松本早生)间，平均值0.79。日本柿，中国柿和近缘种间相似系数平均值分别为0.83，0.81和0.71。期望杂合度和表观杂合度变化范围分别为0.42-0.77和0.27-0.59。 5.利用SRAP标记，使用文献中运用较多的7条正向引物，8条反向引物，通过正反向引物间两两组合，共计得到了72对引物用于扩增，从中筛选出重复性好，谱带清晰且稳定的引物20对。在实验中反向引物序列对扩增结果的影响更大。SRAP扩增的片段大小从200 bp到1500 bp。每对引物组合可产生4～18条清晰可辨的带。根据多态性条带计算的相似系数表明30份材料的相似系数在0.35～0.94之间，平均值0.674。前川次郎和湘西甜柿相似系数最大为0.944。老鸦柿和沙谷一号最小为0.35。 6．根据已发表的柿属植物反转录转座子反转录酶基因序列，使用Primer 5.0软件设计10对IRAP引物，有4对在供试材料中无扩增产物，结合ISSR引物5对，从中筛选出谱带清晰、再现性强的16个引物组合对柿属植物的亲缘关系进行IRAP和REMAP分析。有些IRAP正反向引物组合能扩增出产物，单独却不能；有些正反向引物单独扩增与组合扩增结果差异较大。REMAP利用IRAP正反向引物中的任意一个与ISSR引物组合进行扩增，与单独进行IRAP或ISSR分析的扩增结果均不相同。本试验共扩增出117条带，其中多态位点百分率为86％。扩增片段大小在250～2000 bp之间。供试材料的相似系数变化范围从0.48(浙江柿和老鸦柿)到0.99(次郎和前川次郎)，平均值0.79。 7．本研究采用了四种分子标记技术，即SSR、SRAP、IRAP和REMAP对部分柿属植物的亲缘关系进行分析，统计后分别进行UPGMA，主坐标分析和Wanger简约法进行聚类。分析结果表明不同分子标记技术之间，以及不同的聚类方法之间所反映的材料间的遗传关系的趋势大致相同。三大类分子标记均较好地把供试材料分为三大组，即“日本柿组”、“中国柿组”和“近缘种组”。聚类图所反映的亲缘关系和种质问的地理起源相一致，这表明它们有不同的遗传背景。可能是长期以来在不同的地区独立演化的结果。甜柿和涩柿，不论中国和日本原产种质，在聚类时都不能明显区别开，表明甜柿和涩柿间在遗传背景上差别不是很大，它们间的亲缘关系需要在未来的实验中进一步验证。近缘种在用聚类图、主坐标散点图和无根树反映材料间的遗传关系时，总是明显的聚在一起，与栽培柿完全分开，其中君迁子和油柿与栽培柿的遗传关系较近。来自湖南省湘西自治州的湘西甜柿在聚类时，与日本甜柿聚在一起，并且和前川次郎的相似系数很高，表明湘西甜柿可能具有日本甜柿的血缘。形态特征和几种分子标记所获得的结果都支持金枣柿应为柿属植物中的一个新种。

目录

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摘要

缩略词表

第一章课题的提出和前人研究进展

第二章柿属植物SSR分析技术的建立

第三章柿属植物SSR引物的分离

第四章部分柿属植物亲缘关系的SSR分析

第五章部分柿属植物亲缘关系的SRAP分析

第六章部分柿属植物亲缘关系的IRAP和REMAP分析

第七章总讨论

参考文献

附录

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