Protein Kinase C(Pkc)-Mitogen Activated Protein Kinase (Mapk) Signaling Pathway and Cholesterol Production in Granulosa Cell-Oocyte Co-Culture System in Mice

摘要

在颗粒细胞-卵母细胞共培养减数分裂恢复时期，颗粒细胞与卵母细胞之间能相互影响。颗粒细胞能释放一些卵母细胞生长所需要的物质至培养基中，培养基可以促进这些物质从颗粒细胞传递到卵母细胞。这些分泌因子在卵母细胞发育成熟过程中起重要的作用。在次黄嘌呤抑制的颗粒细胞-卵母细胞共培养体系中，颗粒细胞分泌的因子能使卵母细胞减数分裂的恢复(GVBD)比率达到64.1±1.8%，而卵母细胞单独培养时只为20.4±4.8%。研究表明，虽然卵母细胞单独培养时能从培养基中吸取营养，然而颗粒细胞可以分泌促进卵母细胞成熟的重要成分。这说明，在颗粒细胞中存在一条信号通路。此外，添加FSH后，单独培养的卵母细胞的GVBD率能提高，这说明FSH在卵母细胞减数分裂恢复过程中起到了直接或是间接的作用，但是在本实验的颗粒细胞-卵母细胞共培养的结果证明，添加与不添加FSH培养组之间的GVBD率差异不显著，分别为81.0±0.6%、71.9±0.1%。这些结果说明共培养体系中，颗粒细胞可以不依赖于FSH的作用而分泌促进卵母细胞减数分裂恢复的重要因子。
　　 颗粒细胞分泌因子在颗粒细胞与卵母细胞共培养12h的过程中被释放出来。在这个时间段，利用共培养12小时后去除颗粒细胞后的培养液培养新的卵母细胞细胞中，原来添加FSH组的GVBD率为81.1±1.4%，没有添加FSH组的为71.7±3%。颗粒细胞-卵母细胞共培养12h和24h，GVBD率差异不显著。这些结果表明，12h可以诱导卵母细胞减数分裂成熟启动。FSH培养颗粒细胞12小时后，去掉颗粒细胞后的培养液再培养新的卵母细胞GVBD率为59.9±2.8%，而从颗粒细胞-卵母细胞共培养组收集的培养液继续培养新的卵母细胞的GVBD率为81.1±1.4%。这说明颗粒细胞诱导卵母细胞GVBD时分泌的因子可能是依赖于卵母细胞的。这也表明，颗粒细胞与卵母细胞之间的作用是相互的。
　　 在减数分裂成熟过程中，丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)是两种由颗粒细胞分泌的物质。在添加了10uM MEK抑制剂U0126或是10uM蛋白合成抑制剂亚胺环己酮时，FSH就不能诱导卵母细胞GVBD。在添加了U0126的卵母细胞单独培养组以及颗粒细胞-卵母细胞共培养组，由于U0126能抑制MAPK的激活、从而降低了GVBD率，其GVBD率分别为24.12%和25.86%。在上面两组中收集的培养液也不能支持新的卵母细胞的GVBD。MAPK信号通路在颗粒细胞和卵母细胞成熟中起重要作用。在成熟过程中，颗粒细胞和卵母细胞表达的磷酸化的MAPK能通过免疫组织化学分析检测到。蛋白质印迹结果显示，U0126以及Staurosporine(总的PKC抑制剂)使得FSH不能诱导MAPK磷酸化且降低GVBD率(卵母细胞单独培养时为8.8±1.5%，颗粒细胞和卵母细胞共培养时为19.8±5.2%)。PKC信号通路在颗粒细胞和卵母细胞成熟中起到关键作用。在颗粒细胞中，PMA(总PKC激活剂)或OAG(nPKC激活剂)可以激活卵母细胞核颗粒细胞中的PKC成员，包括αβγ(cPKC)，δε(nPKC)以及ζ(aPKC)。卵母细胞单独培养，添加不同亚型的PKC抑制剂组结果为，Hispidin(32.65%±8.2)和Bisindolylmaleimide(31.4±2.5%)组GVBD率显著高于(P<0.05)总PKC抑制剂组8.8±1.5%，这些结果暗示卵母细胞中，有6种PKC亚型参与诱导GVBD。蛋白质印迹表明，Staurosporine能阻碍颗粒细胞中MAPK的磷酸化。MAPK存在于PKC通路的下游。
　　 信号通路与代谢活性是颗粒细胞和卵母细胞相互作用的重要方面。蛋白合成以及磷酸化参与了FSH诱导的减数分裂恢复。有研究报道，蛋白合成抑制剂CHX能影响GVBD率，在添加有FSH的卵母细胞单独培养以及颗粒细胞-卵母细胞共培养时12h后，GVBD率分别为30.0%和48.9%，表明，在颗粒细胞和卵母细胞中，CHX使得FSH不能诱导蛋白合成。CHX处理培养12小时后，去除颗粒细胞后的培养液不能为新的卵母细胞生长提供足够的营养。另外，在培养24h后去除颗粒细胞后的培养液不能有效支持新的卵母细胞的GVBD，从卵母细胞单独培养、颗粒细胞单独培养以及颗粒细胞和卵母细胞共培养后获取的培养液对新的卵母细胞的GVBD率分别为：33.9%、29.9%以及46.6%。蛋白质印迹分析表明，CHX不能抑制MAPK磷酸化，但是能降低卵母细胞的GVBD率。表明，MAPK和蛋白合成通过不同的信号通路诱导减数分裂恢复，或者说是MAPK是蛋白质合成以及卵母细胞GVBD的上游分子。考马斯亮蓝染色结果表明，FSH处理后的颗粒细胞的蛋白多于U0126、CHX以及Staurosporine处理后的颗粒细胞中的蛋白量，颗粒细胞中蛋白质的合成参与卵母细胞的成熟。另外，除了蛋白质，胆固醇也参与了FSH诱导的减数分裂恢复。在添加FSH后的颗粒细胞组，胆固醇含量增加至0.24±0.49 umol/lmg，然而Staurosporine、U0126以及CHX能降低其含量，分别为：0.02±0.003 umol/lmg、0.12±0.016 umol/lmg以及0.04±0.001 umol/lmg。这些结果说明PKC和蛋白质合成能影响颗粒细胞中胆固醇的合成。
　　 总之，本实验结果表明，颗粒细胞-卵母细胞共培养12h时能分泌出卵母细胞生长所需要的因子。PKC、MAPK、蛋白质以及胆固醇都是颗粒细胞的分泌因子，MAPK存在PKC信号通路的下游。另一方面，颗粒细胞中的MAPK以及蛋白质合成受到不同信号通路的刺激。在颗粒细胞中，至少PKCα，β，γ，δ，ε，ζ参与了卵母细胞减数分裂恢复的调控，在卵母细胞中存在不少于6种PKC亚型与其减数分裂恢复有关。颗粒细胞中的PKC、MAPK以及蛋白质合成能够介导FSH对胆固醇合成的促进作用。

目录

文摘

英文文摘

ABBREVIATION

LIST OF TABLES

LIST OF FIGURES

1 Introduction

1.1 Meiotic maturation

1.1.1 Germinal Vesicle(nucleus)

1.1.2 Germinal Vesicle Break Down(GVBD)

1.1.3 Polar Body Emission

1.2 In Vitro Maturation

1.2.1 The culture medium

1.3 Bidirectional Communication Between Oocytes and Granulosa cells

1.3.1 The Roles Of Denuded Oocytes

1.3.2 The Roles of Granulosa Cells

1.3.3 Metabolic Activity

1.3.4 PKC and MAPK Signaling Pathways

1.4 The Objectives of The Experiment

2 Materials and Methods

2.1 Animals

2.1.1 Samples Collection

2.2 The chemicals

2.2.1 Preparation of HX-TCM199

2.2.2 Preparation of Follicle Stimulating Hormone(FSH)

2.3 Experimental Design

2.4 Analysis

2.4.1 Cholesterol Analysis

2.4.2 Western Blot Analysis

2.4.3 Immunohistochemistry

2.4.4 Commassive Brilliant Blue Staining

2.5 Statistical Analysis

3 Results

3.1 The Role of Granulosa Cells on Meiotic Maturation

3.2 MAPK Phosphorylation and Protein Synthesis During Meiotic Maturation

3.3 The Role of Different PKC Isoforms on Meiotic Maturation

3.4 Cholesterol Metabolism

3.5 Protein Phosphorylation During Meiotic Maturation

4 Discussion

5 Conclussion

REFERENCES

ACKNOWLEDGEMENTS