灰葡萄孢细胞自噬相关基因BcATG26、BcATG17和BcATG14的功能研究

摘要

灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可危害一些重要经济作物，造成巨大的经济损失。目前细胞自噬在灰葡萄孢中的研究较少，在真核生物中，细胞自噬过程可维持细胞内的生理平衡，有助于细胞度过逆境，并影响一些丝状真菌细胞的分化及致病力。本研究在灰葡萄孢基因组数据库中下载3个自噬相关基因的序列，即BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868，对其进行了基因结构和同源性分析，采用Split-marker技术在野生型菌株B05.10中对其分别进行了敲除，最后对敲除突变体的菌丝生长、菌核产生、营养需求和致病力等方面进行了测定。取得的研究结果如下:
　　(1)通过在NCBI上BLAST比对以及构建进化树，证实了BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868分别与多物种的自噬基因ATG26、ATG17和ATG14有同源性，因此命名为BcATG26、BcA TG17和BcA TG14。
　　(2)通过Split-marker技术分别敲除基因BcATG26、BcA TG17和BcATG14，经过PCR和Soutnern blot验证，获得了基因缺失突变体△BcATG26、△BcA TG17和△BcATG14。
　　(3)明确了自噬基因BcATG26、BcA TG17和BcA TG14在自噬过程中的重要作用。用MDC染色，B05.10的菌丝在激光共聚焦显微镜下出现大量的荧光颗粒，而△BcATG26-13、△BcATG17-6和△BcATG14-107的菌丝细胞中未见或者有极少数的荧光颗粒，自噬基因的敲除阻断了自噬过程，导致不能形成自噬体或者自噬小体。
　　(4)细胞自噬影响灰葡萄孢菌丝生长和菌核发育。基因缺失突变体在菌丝生长和菌核形成方面与野生型菌株B05.10有差异。在PDA培养基上，△BcA TG26-13相对于野生型菌株B05.10，菌核黑化延迟，15d仍为黄色;而△BcATG14-107只能形成很小的菌核。在1/8 PDA、DM、DM-C和DM-N培养基上，与野生型菌株B05.10相比，△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌丝生长速度减慢，菌落发育畸形。
　　(5)细胞自噬影响灰葡萄孢致病力。用菌丝块离体接种烟草叶片、活体接种烟草叶片和离体接种草莓叶片测定致病力，结果表明，△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107的致病力与野生型菌株B05.10相比有极显著差异(P＜0.01)。
　　(6)细胞自噬可能影响灰葡萄孢耐受过氧化氢(H2O2)和植保素(camalexin)的胁迫。在添加有H2O2或者植保素camalexin的PDA上，与野生型菌株B05.10相比，△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌丝生长速度减慢，菌落发育畸形，即对H2O2和camalexin更为敏感。
　　以上结果表明，细胞自噬在灰葡萄孢菌丝生长、菌核的形成和发育、对寄主植物的致病力以及病原菌耐受活性氧（ROS）和植保素camalexin的胁迫等方面都起着重要作用。解析灰葡萄孢细胞自噬相关基因的功能可为更好的防治灰霉病提供理论基础。

目录

声明

摘要

1 灰葡萄孢和灰霉病

1．1 灰葡萄孢的经济重要性

1．2 灰葡萄孢的分类属性

1．3 灰葡萄孢的生物学特性

1．4 灰霉病的病害循环

1．5 灰霉病的防治

2 细胞自噬(autophagy)

2．1 细胞自噬概述

2．2 细胞自噬的类型

2．3 酵母中细胞自噬过程

2．4 细胞自噬的主要研究方法

2．5 子囊真菌中自噬的研究进展

3 本研究的意义和内容

3．1 研究的意义

3．2 研究的内容

第二章 灰葡萄孢细胞自噬相关基因BcATG26、BcATG17和BcATG14的序列分析和表达模式分析

1 试验材料

1．1 供试菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要培养基

1．4 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 构建系统进化树

2．2 菌丝准备及核酸提取

2．3 cDNA的合成

2．4 实时荧光定量PCR分析

3 结果与分析

3．1 基因BcATG26、BcATG17和BcATG14的序列分析

3．2 基于BcATG26、BcATG17和BcATG14基因的系统进化树分析

3．3 基因BcATG26、BcATG17和BcATG14的表达模式

4 讨论

第三章 灰葡萄孢细胞自噬相关基因BcATG26、BcATG17和BcATG14的功能研究

1 试验材料

1．1 供试菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要培养基

1．4 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 原生质体的制备

2．2 基因敲除及敲除转化子的获得

2．3 敲除转化子的获得与验证

2．4 敲除转化子的生物学特性

2．5 致病力测定

2．6 自噬结构的观察

3 结果与分析

3．1 基因BcATG26、BcATG17和BcATG14敲除转化子的筛选和验证

3．2 敲除转化子表型分析

3．3 敲除转化子致病力测定

3．4 细胞自噬结构的观察

4 讨论

4．1 细胞自噬与灰葡萄孢菌核形成和发育的联系

4．2 细胞自噬与灰葡萄孢致病力的联系

4．3 细胞自噬与灰葡萄孢抗H2O2和植保素camalexin胁迫的联系

4．4 自噬结构的观察

第四章 全文总结和展望

2．3 进一步研究自噬与灰葡萄孢致病力的联系

参考文献

附录

致谢