构建siRNA抑制阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达治疗ED的研究

摘要

目的：构建特异性siRNA，利用质粒及病毒载体抑制人和大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达，研究RNAi在ED基因治疗中的作用。
　　 方法：①根据人PDE5A3 mRNA选取2条靶序列，合成互补寡核苷酸链后分别与带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记的pEGFP6-1、pGenesil-1质粒载体连接并转化细菌，扩增、纯化后得到所需质粒。转染人阴茎海绵体平滑肌细胞,荧光显微镜下观察转染结果，流式细胞仪测定转染效率。②通过筛选，将人PDE5A3基因有抑制作用的3个siRNA表达框与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达框同时克隆于真核表达载体pGenesil-1中，再亚克隆至穿梭质粒pShuttle2中。通过归位内切酶I-CeuI/PI-SceI将目的表达序列亚克隆至腺病毒骨架载体pAdeno-X中，产生携带3条siRNA表达框和EGFP表达框的重组腺病毒质粒。经PCR及酶切确认后以PacI酶线性化并转染HEK293A细胞包装重组腺病毒颗粒。观察EGFP表达及PCR扩增出目的基因等方法加以鉴定。半数组织培养感染量(TCID50)法测定病毒滴度。③将其转染体外原代培养的人阴茎海绵体平滑肌细胞48h和72h后，用RT-PCR和Western blot法检测海绵体平滑肌细胞内PDE5A3基因的表达水平。④原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞，PCR法克隆其PDE5基因，根据其碱基序列选择靶序列，设计、合成6条siRNA片段并制备6个siRNA表达质粒。将PDE5基因表达框亚克隆至带EGFP标记的pIRES2质粒载体上，构建双基因共表达载体PIRES2-EGFP-PDE5。将该载体与分别与6个siRNA表达质粒共转染HEK293A细胞，培养48h后通过荧光显微镜观察并摄片，RT-PCR及Western blot检测PDE5 mRNA与蛋白的表达。将筛选出的对大鼠PDE5基因有抑制作用的2个siRNA表达框与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达框同时克隆于真核表达载体pGenesil-1中，再亚克隆至穿梭质粒pShuttle2中。同法构建携带2条siRNA表达框的重组腺病毒质粒并测定其滴度，为下一步进行动物模型研究奠定基础。
　　 结果：酶切电泳及基因测序证实siRNA及真核表达载体构建成功。转染阴茎海绵体平滑肌细胞48h后，在荧光显微镜下可见较亮的绿色荧光，平均转染效率为17.95％。构建重组腺病毒载体rAd5-siRNA-PDE5A3，测序证实目的基因序列及插入方向正确，酶切鉴定、荧光观察及PCR结果证明构建成功，病毒滴度达8.0×108pfu/ml。感染重组腺病毒后的所有HEK293A细胞均有绿色荧光蛋白表达。扩增及纯化重组腺病毒rAd5-siRNA-PDE5A3及对照病毒Ad5-EGFP，转染人阴茎海绵体平滑肌细胞效率可达95％以上，PDE5A3基因表达在mRNA水平抑制48h为(71.7％±2.30)％，72h为(70.8±3.61)％，在蛋白水平抑制48h为(78.3±3.33)％，72h为(77.5±2.67)％(P<0.01)。6个大鼠PDE5特异性siRNA重组质粒及大鼠PIRES2-EGFP-PDE5双基因共表达载体经酶切及测序鉴定证实构建成功，共转染特异性siRNA表达质粒组的EGFP荧光强度明显弱于对照组。RT-PCR 及Western blot 结果显示，重组质粒Pgenesil-2-siRNA4抑制大鼠PDE5表达最为显著，mRNA和蛋白表达抑制率分别为(68.59±3.23)[％]和(71.25±2.91)[％]。其次为Pgenesil-2-siRNA6，对PDE5 mRNA和蛋白表达的抑制率是(55.02±3.44)[％]和(65.09±3.05)[％]。将4号及6号质粒继续构建病毒载体，测序证实目的基因序列及插入方向正确，酶切鉴定、荧光观察及PCR结果证明rAd-siRNA-rPDE5重组腺病毒载体构建成功，病毒滴度达8.0×108pfu/ml。感染重组腺病毒后的所有HEK293A细胞均有绿色荧光蛋白表达。
　　 结论：成功构建了两种针对PDE5A3基因特异性抑制的 siRNA真核表达载体，并能在靶细胞内有效表达。含3条人PDE5A3基因siRNA片段的重组腺病毒载体构建成功，在真核细胞内表达的shRNA能显著地抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达；成功构建了大鼠特异性siRNA表达质粒和PIRES2-EGFP-PDE5双基因共表达载体并共转染HEK293A细胞。RNAi可显著抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达，快速筛选出有效siRNA序列并成功构建含2条大鼠PDE5基因siRNA片段的重组腺病毒，为进一步开展ED的基因治疗研究提供了实验基础。