肝癌异常表达microRNAs的鉴定、功能、作用靶点以及治疗潜力研究

摘要

目的原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma；HCC；肝癌）是一种全球性人类恶性肿瘤，具有高发病率和高死亡率特点,但缺乏有效的靶向治疗。当前诊断肝癌的生物标志物主要是甲胎蛋白（AFP），但有20％到40％的患者AFP呈阴性或低度阳性。手术切除或肝移植仍然是目前治疗肝癌的首选，但只有不到20％的肝癌病人适合外科治疗，并且术后复发率高，5年存活率只有30％到40％。肝癌病人的结局如此凄凉的主要原因是我们对肝癌发病的分子机制仍知之甚少和缺乏有效的靶向治疗。因此，致力于阐明肝癌的发生发展机制，探索新的早期诊断生物标志物和更有效的治疗方法是一项十分紧迫的研究课题。MicroRNAs (miRNAs)是近年新起的一个研究领域，为一组保守的非编码小RNA，通过转录后水平调控基因的表达。MiRNAs表达水平的改变能够调节肿瘤发生相关的重要生物学过程，因而系统评价某种确定表型肿瘤miRNA表达谱的变化将有利于我们更深入的理解肿瘤发生发展的机制。本研究拟应用肝癌细胞细胞株与原代正常肝细胞miRNA表达谱差异这一全新的策略鉴定出肝癌异常表达的miRNAs，并进一步系统的研究这些miRNAs的功能、作用靶点以及治疗潜力。
　　 方法 应用Agilent human miRNA array分析7株肝癌细胞株和3例原代正常肝细胞的miRNA表达谱，通过比较得到肝癌中异常表达的miRNAs，并用TaqMan Qrt-PCR进行确认。在细胞水平上转染miRNA前体或抑制剂以及相应的对照miRNA，通过细胞增殖、细胞周期和凋亡分析、细胞迁移与侵袭以及克隆形成实验，探讨这些异常表达的miRNAs在肝癌发生发展中的作用。利用生物信息学技术如miRBase、TargetScan、PicTar等数据库，预测miRNA的作用靶点，再通过SYBR Green定量PCR、Western Blot以及Luciferase精确靶点实验，验证肝癌相关miRNAs的作用靶点，从而阐明这些异常表达的miRNAs在肝癌发生中，类似于抑癌基因或癌基因的分子作用机制。利用肝癌裸鼠移植瘤模型，探索这些异常表达的miRNAs分子或其拮抗剂在肝癌治疗中的潜力。
　　 结果通过比较肝癌细胞株与原代正常肝细胞的miRNA表达谱差异获得肝癌异常表达miRNAs 37个（2-fold change，P＜0.05)。 我们证实上调的miR-221和下调的miR-375通过调控细胞增殖、周期、凋亡、迁移侵袭以及克隆形成参与了肝癌的发生发展。miR-221作用其靶点BMF、BBC3和ANGPTL2而作用类似于癌基因，miR-375作用其靶点LAMC1和PDGFC而作用类似于抑癌基因。治疗性的应用慢病毒介导的anti-miR-221或胆固醇修饰的miR-375类似物可以有效的抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长。
　　 结论通过比较肝癌细胞株与原代正常肝细胞的miRNA表达谱差异可以高效鉴定出肝癌特异性的miRNAs。这些异常表达的miRNAs通过作用其靶点，调节了肿瘤发生相关的重要生物学过程，从而参与了肝癌的发生和发展。实验结果显示慢病毒介导的anti-miR-221或胆固醇修饰的miR-375类似物对治疗肝癌有良好的潜力。所有这些，使我们相信基于miRNAs的诊断和治疗在抗肝癌研究中具有诱人的前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分 肝癌异常表达microRNA的鉴定

第二部分 肝癌异常表达microRNAs的功能研究

第三部分 肝癌异常表达microRNAs的靶点研究

第四部分 肝癌异常表达microRNAs的治疗潜力探讨

参考文献

综 述MicroRNAs与肝癌

附录

致 谢