突变亨廷顿蛋白通过异常募集和裂解钙反应性反式激活子CREST产生细胞毒性

摘要

亨廷顿病(Huntington’s disease, HD)是一种常染色体显性遗传、迟发性神经退行性疾病，病理学特征为纹状体和大脑皮质神经元选择性丢失。亨廷顿病由HD基因突变所致。正常HD基因编码亨廷顿蛋白（huntingtin, Htt），突变HD基因第一外显子中CAG重复序列异常增加超过35次，编码产生含有超长多聚谷氨酰胺扩展片段(polyQ)的突变Htt。突变Htt在神经元内错误折叠，形成异常构象。错误折叠的突变Htt在神经元细胞核和胞质内形成核内聚集物（nuclear aggregate）和神经毡聚集物(neuropil aggregate)。突变Htt聚集物是HD神经病理学损害的重要物质基础。
　　许多研究表明，多种神经退行性疾病中普遍存在着成熟神经元细胞的周期再进入现象，成熟神经元的各种细胞周期蛋白表达异常升高，树突数量及其分枝减少，树突棘密度降低、体积减小。这种功能丢失、形态退化的周期再进入现象会直接导致终末分化神经元的损伤和凋亡。在HD患者和动物模型中也检测到相似的成熟神经元细胞周期再进入、神经元发育异常等现象。以前的研究也发现，突变Htt具有抑制神经元突起生长等分化发育异常作用。
　　钙反应性反式激活子(calcium-responsive transactivator, CREST)是于2004年用反式激活因子陷阱(transactivator trap)的方法发现的一种在脑内较高水平表达的核蛋白，具有钙离子依赖性反式激活作用。CREST在脑内的表达与神经元的发育密切相关，在促进神经元树突的生长和分枝发育，以及维持成熟神经元的形态和功能方面具有重要作用。前期利用小鼠成神经瘤细胞（N2a细胞）研究表明，CREST具有抑制N2a细胞的细胞周期，促进其分化的作用。
　　突变Htt对细胞周期和神经元分化的影响与CREST在神经元分化中的促进作用提示，突变Htt可能通过影响CREST的表达和/或功能而产生神经元毒性。为了证明这一假设，进一步揭示突变Htt的致病机制，本研究在观察了CREST是否促进神经干细胞分化的基础上，分析了突变Htt对CREST表达水平的影响及与CREST的相互作用，并检测了CREST对突变Htt细胞毒性的影响。
　　1. CREST促进神经干细胞的分化为了进一步证明CREST在神经元分化发育中的作用，对分离培养的小鼠神经干细胞在诱导分化后CREST表达水平的变化及沉默CREST后神经干细胞分化能力的改变进行了检测。用5％胎牛血清诱导后，免疫荧光染色显示，NeuN表达逐渐增强的细胞中CREST免疫反应性也逐渐增强；免疫印迹和RT-PCR分析显示，细胞内CREST蛋白水平随着诱导分化时间的延长而逐渐增加，mRNA表达水平在诱导分化1d后即明显增加，3d后达到高峰，5d时增加幅度减小，7d时与未诱导分化细胞相同。在神经干细胞中转染CREST SiRNA并用5％胎牛血清诱导分化72h后，免疫荧光标记显示，与转染对照SiRNA的细胞比较，NeuN阳性的细胞数目减少，表达胶质细胞纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的细胞数量增加；RT-PCR分析显示，转染CREST SiRNA的细胞中神经元树突、轴突发育标志物及神经元成熟标志物的mRNA表达水平均明显低于对照细胞。由此提示，CREST具有促进神经干细胞向神经元分化的作用。
　　2.突变Htt降低CREST水平为了了解突变Htt是否影响CREST的表达，对HD转基因小鼠脑内、转染表达突变Htt的N2a细胞及神经干细胞内CREST表达水平进行了检测。免疫印迹和免疫组织化学染色显示，与野生型小鼠比较，表达含82个谷氨酰胺重复序列的人突变Htt氨基末端171个氨基酸的TG小鼠和表达含有150个谷氨酰胺重复序列的人突变Htt氨基末端的R6/2小鼠大脑皮质、纹状体、海马等脑区内CREST蛋白水平或免疫反应性显著降低；在转染表达突变Htt（Htt-160Q）的N2a细胞中，免疫印迹检测也发现CREST蛋白水平明显低于转染表达正常Htt（Htt-20Q）的N2a细胞；免疫荧光分析表明，表达突变Htt能显著降低神经干细胞内CREST免疫反应性。然而，在HD转基因小鼠脑内和表达Htt-160Q的N2a细胞内，进一步的RT-PCR及定量PCR分析均未检测到CREST mRNA表达水平的明显改变。突变Htt不影响CREST mRNA表达水平的结果提示，突变Htt降低CREST水平的作用通过翻译后水平产生。
　　3.突变Htt通过其脯氨酸富集区异常募集CREST突变Htt，尤其是其聚集物，在细胞内对多种分子具有募集作用，并通过这种异常募集而损害这些分子的功能。突变Htt也可能通过异常募集CREST而影响其功能进而产生相应的神经病理学损害。免疫组织化学染色发现，在R6/2小鼠大脑皮质、纹状体和海马中，CREST免疫反应产物不仅较野生型小鼠减少，并由弥散分布变为颗粒状分布，形成大小不等的聚集物。在R6/2小鼠脑切片上和表达突变Htt的N2a细胞内，免疫荧光双标观察可见CREST与突变Htt共定位于聚集物内。活细胞激光扫描共聚焦显微镜动态成像还观察到突变Htt将CREST募集到聚集物中的动态过程。对表达突变Htt的N2a细胞的免疫印迹检测显示，在突变Htt聚集物滞留的浓缩胶内也含有CREST；滤过陷阱分析检测到，CREST和突变Htt聚集物均能被阻留在滤膜上；对分离提取的聚集物进行免疫印迹分析显示，聚集物内不仅含有突变Htt，也含有CREST。这些结果均表明突变Htt可异常募集CREST。
　　对表达突变Htt的N2a细胞进行免疫共沉淀分析表明，Htt-160Q与CREST的结合能力较Htt-20Q明显增强；将表达分别连接HA-GFP的Htt羧基末端第1-17氨基酸（N17Htt）、Poly-Q（Q96）和脯氨酸富集区（PRRHtt）3个不同片段的质粒分别转染N2a细胞后进行免疫共沉淀分析，发现3个片段均能与CREST结合，其中N17Htt片段结合力最弱，PP片段结合力最强但仍弱于Htt-160Q。由此证明，突变Htt主要通过其脯氨酸富集区异常募集CREST。
　　4.突变Htt通过钙蛋白酶促进CREST的裂解由于突变Htt降低CREST水平不是因其抑制CREST基因的转录所致，而突变Htt可激活多种caspase和钙蛋白酶（calpain）等蛋白酶活性，因此，突变Htt可能通过促进CREST的裂解而降低其水平。为了证明这一假设，首先分析了R6/2小鼠脑内和表达突变Htt的N2a细胞内CREST不同裂解片段水平的变化。CREST免疫印迹分析显示，野生型小鼠脑组织内或转染表达Htt-20Q的N2a细胞中均存在多个能被C-350aa CREST抗体所识别的裂解片段；与野生型小鼠或转染Htt-20Q的N2a细胞比较，在R6/2小鼠脑组织内或转染表达Htt-160Q的N2a细胞中，大小为35 kDa左右的裂解片段水平增加最为明显，表明突变Htt确能促进CREST的裂解。
　　为了明确突变Htt通过促进何种蛋白酶、在CREST何处裂解而产生该35 kDa片段，对CREST进行了生物信息学分析，发现CREST分子中没有任何caspase酶切位点，但有多个可能的钙蛋白酶位点。将表达CREST氨基末端连接HA、羧基末端连接flag的质粒分别与表达Htt-20Q和Htt-160Q的质粒共转N2a细胞，分别用HA、flag和CREST抗体进行免疫印迹分析，发现只有flag抗体和CREST抗体能在转染表达Htt-160Q的N2a细胞中检测到较多的大小为35kDa左右的片段；当用钙蛋白酶抑制剂calpeptin处理后，全长CREST的裂解和35 kDa片段的产生均明显减少，表明该片段是钙蛋白酶裂解CREST产生的CREST羧基末端片段。构建表达羧基末端连接flag、不含生物信息学分析得分较高且可能产生35kDa羧基末端片段的钙蛋白酶裂解位点的CREST质粒，将其分别与表达Htt-20Q和Htt-160Q的质粒共转N2a细胞后，用抗flag抗体进行免疫印迹分析，发现缺失132-139aa和138-146aa的CREST在表达Htt-160Q和Htt-20Q的细胞中不能产生35kDa羧基末端片段，而其他缺失钙蛋白酶可能裂解位点的CREST在表达Htt-160Q的细胞中仍产生高水平的35kDa羧基末端片段。因此，被突变Htt激活的钙蛋白酶主要在CREST的132-139aa和138-146aa部位对其进行裂解。
　　5.过表达CREST抑制突变Htt细胞毒性为了明确突变Htt的细胞毒性是否与其对CREST水平的下调有关，进而观察了过表达CREST对突变Htt细胞毒性的影响。台盼蓝和碘化丙啶（PI）染色显示，在表达突变Htt的N2a细胞中过表达CREST，可明显降低被台盼蓝或PI染色的细胞比率。对用无血清诱导分化后生长的长度超过胞体直径2倍的突起计数表明，过表达CREST可明显纠正突变Htt对N2a细胞突起生长的抑制。由此表明，过表达CREST可抑制突变Htt对细胞活力和分化的毒性。
　　本研究进一步证明了CREST在神经元分化发育中的作用，为揭示突变Htt神经病理学毒性机制和探索治疗HD的方法提供了新的依据。
　　（1）CREST可促进或介导神经干细胞向神经元的分化发育。
　　（2）突变Htt可通过对CREST的异常募集和通过钙蛋白酶对CREST的裂解损害CREST的功能，进而产生细胞毒性。
　　（3）阻断突变Htt对CREST的异常募集、选择性抑制钙蛋白酶对CREST的过度裂解及促进CREST的表达可作为探索治疗HD方法的方向。

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突变亨廷顿蛋白通过异常募集和裂解钙反应性反式激活子CREST产生细胞毒性

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神经干细胞在神经损伤修复中的应用

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