锌离子通过磷酸化酪氨酸15位点激活CDK-5介导缺血性脑损伤

摘要

锌离子是人体必需微量元素之一，参与调节多种酶类的活性，在神经传导中具有重要作用。有文献报道在缺血性脑损伤中，锌离子在大脑皮质、丘脑、纹状体、杏仁核，特别是海马门区和CA1区聚集，螯合锌离子可阻止神经元退变的发生。另有报道，细胞周期素依赖性蛋白激酶5（CDK5）通过磷酸化NMDA受体介导了海马CA1区神经元缺血性损伤。然而锌离子是否是通过调节CDK5的活性促进神经元的损伤，目前尚无报道，其内在调节机制有待研究证实。
　　目的：探讨锌离子对细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5的调节及其在缺血性脑损伤中的作用。
　　材料和方法：
　　1.建立大鼠大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型，选用Sprague Dawley（SD）大鼠，进行单侧大脑中动脉栓塞术。实验分为三组：假手术组（Sham）组、大脑中动脉栓塞组（MCAO）组和腹腔注射锌离子螯合剂Clioquinol(CQ)+MCAO组，每组12只。单侧大脑中动脉缺血1小时再灌注6小时后取材，取新鲜大脑速冻后切片，进行TTC染色，整体观察脑组织损伤面积。采用4％的多聚甲醛灌流固定及后固定，脱水后冰冻切片，尼氏染色观察神经元数目。用免疫印迹法和免疫沉淀法检测相关蛋白水平及活性。
　　2.培养小鼠成神经瘤N2a细胞，分为对照（Control）组和锌处理（ZnSO4）组，无血清孵育3小时。收集蛋白，用免疫印迹法和免疫沉淀法检测相关蛋白的表达和活性变化。
　　结果：在大脑中动脉栓塞模型中，MCAO组较Sham组海马区域神经元存活数目明显减少，CDK5的活性明显增加，伴随Y15位点磷酸化水平增高。锌离子螯合剂CQ腹腔注射可明显逆转神经元的死亡、CDK5的活化及Y15位点磷酸化。在细胞水平，锌离子孵育可显著增加CDK5-Y15位点的磷酸化水平及活性，锌离子对CDK5无直接活化作用，但能够抑制钙蛋白酶Calpain的活性。
　　结论：在缺血性脑损伤中，锌离子通过磷酸化CDK5酪氨酸15位点激活CDK5而介导神经元损伤。

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主要英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一、 主要实验仪器

二、主要实验试剂

三、大鼠大脑中动脉栓塞术

四、N2a 细胞培养和处理

五、蛋白免疫印迹

六、尼氏染色

七、CDK5激酶活性测定

八、TTC染色

九、图像数据分析

结果

一、在大鼠脑缺血再灌注模型中，CDK5的活化介导了神经元死亡，伴随CDK5-Y15磷酸化水平增高。

二、在整体动物模型中，腹腔给予锌离子螯合剂CQ可以明显减少神经元的死亡，逆转CDK5的激活及Y15位点磷酸化。

三、在N2a细胞上，给予ZnSO4处理，CDK5活性及Y15位点磷酸化水平明显上升。

四、锌离子对CDK5无直接活化作用, 但能够抑制Calpain的活性。

讨论

小结

创新点

参考文献

综述: 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5在神经退行性疾病中的研究进展

致谢

附录