猪原始生殖细胞体内跟踪、体外培养及遗传印记的研究

摘要

胚胎生殖细胞(EG)是从胎儿原始生殖细胞(PGCs)分离培养出来的具有发育多潜能性的一种多潜能干细胞。传统的胚胎干细胞(ES)多从囊胚的内细胞团(ICM)获得，如小鼠ES。但对大家畜而言，很难获得充足的囊胚，ES建系也还没有成功。自从PGCs来源的小鼠EG细胞建立后，通过检测mEG的生物学特性和mES相似，使人们有理由相信，由其他物种的PGCs也同样能够获得EG细胞。虽然关于猪EG细胞的获得早有报道，但是，至今仍然未能建成与小鼠ES和EG一样稳定的细胞系。原因是多方面的，一是我们对猪PGCs的发生、增殖、迁移等过程缺少了解;二是我们对猪PGCs的表观遗传学变化研究甚少;三是PGCs细胞体外培养体系仍有待完善。本研究选择猪胚胎发育22天至30天的生殖嵴为研究对象，通过组织切片技术对生殖嵴形态及PGCs在体内的迁移进行了跟踪;利用Realtime PCR及亚硫酸氢盐测序技术对印记基因的表达及甲基化水平进行了分析;通过对不同胎龄、不同饲养层、不同的传代方法的比较对类EG细胞的培养条件进行了优化，期望在认知猪PGCs体内生物学变化规律的基础上优化体外培养条件，最终获得稳定传代的猪EG细胞系。主要研究结果如下:
　　 (1)组织切片HE染色法跟踪了猪生殖嵴形态变化。在胚胎发育的22天还没有形成生殖嵴;24天，中肾内侧壁局部增厚;26天，已经能够看到明显的两条细长的索状结构出现;28天，中肾内侧壁继续增厚，生殖嵴变大，凸向体腔;30天，生殖嵴发育形成可以独立分离的结构，凸向体腔。
　　 (2) Oct4、Stella及Fragilis三个生殖细胞特异标记物对PGCs进行了体内跟踪。胚龄22天，生殖嵴及附近没有观察到PGCs;24天，尽管中肾内侧壁增厚，但是也未发现PGCs;26天，可见少量PGCs进入生殖嵴，但是大部分PGCs还在生殖嵴附近的肠系膜处;28天，PGCs大部分已经进入到生殖嵴;胚胎发育第30天时，PGCs几乎全部进入生殖嵴而且有聚集的趋势。
　　 (3)通过Realtime PCR的方法，分析了印记基因Igf2、H19、Xist、Peg3、Grb10、Diras3及Plag11在PGCs中的表达，结果显示，Igf2、H19及Diras3基因在22及24天的表达量明显低于26天，Grb10在28天的表达量达到最高。雌性PGCs中Xist基因在30天时表达量明显升高。
　　 (4)采用亚硫酸氢盐测序的方法，分析了22-30天PGCs中Igf2和H19两个印记基因的甲基化情况。实验结果显示，在26天前二者DMR的甲基化呈逐渐降低的趋势，26天达到最低;之后，甲基化水平逐渐升高。Igf2和H19两个印记基因在体外培养的类EG细胞中呈高甲基化状态。
　　 (5)本研究分离了不同阶段的PGCs进行体外培养，从胚胎发育24-28天的PGCs得到了类EG细胞，而在22和30天的胚胎中我们并没有观察到明显的克隆形成。比较24、26和28天的细胞克隆数及传代能力，26天的PGCs用于类EG培养具有优势。
　　 (6)本研究通过比较小鼠成纤维细胞、猪胎儿成纤维细胞及猪性腺-中肾区基质细胞共培养的方法，在原代培养中，性腺-中肾区基质细胞的培养效果要好于其它两种，而在传代培养中，三者的差异并不显著。最终采用与猪性腺-中肾区基质细胞共培养的方法得到了类EG细胞，但所得的类EG细胞在体外最高传至12代，并未建立稳定的能够体外长期传代的猪EG细胞系，说明我们的培养条件还是不够理想，仍需继续优化。
　　 (7) Realtime PCR及免疫荧光检测证明猪类EG细胞表达多能性基因Oct4、Sox2及Nanog;免疫荧光检测证明其表达胚胎阶段特异性抗原SSEA3和SSEA4; TRAP-PCR检测表明猪类EG细胞具有端粒酶活性; Realtime PCR检测证明EG细胞有Xist基因的表达。
　　 (8)本研究通过EG细胞延迟传代自发分化得到了具有上皮样、成纤维样及神经样的细胞;通过EG细胞体外悬浮培养形成拟胚体，贴壁培养后能够分化成具有三个不同胚层来源细胞特征的细胞，显示得到的类EG细胞具有多向分化潜能。
　　 (9)本研究通过EG细胞体外定向诱导分化，得到了具有向成骨细胞、成脂细胞及神经细胞分化的细胞，进一步说明了猪EG细胞的多向分化潜能。
　　 总之，本研究从妊娠24～26天猪的PGCs获得了具有一定传代能力的猪EG细胞，并且证实了猪EG体外具有体外多向分化潜能。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪多能干细胞研究进展

1．1．1 胚胎干细胞(ES)的研究进展

1．1．2 诱导多能干细胞(iPS)的研究进展

1．1．3 胚胎生殖细胞(EG)的研究进展

1．2 哺乳动物原始生殖细胞的发育

1．2．1 原始生殖细胞特化的信号调控

1．2．2 小鼠原始生殖细胞的迁移

1．2．3 人原始生殖细胞的迁移

1．2．4 猪原始生殖细胞的迁移

1．2．5 原始生殖细胞甲基化的去除与重建

1．3 胚胎生殖细胞培养的影响因素

1．3．1 饲养层对胚胎生殖细胞的影响

1．3．2 细胞生长因子对胚胎生殖细胞的影响

1．3．3 胚胎日龄对胚胎生殖细胞的影响

1．3．4 分离方法对胚胎生殖细胞的影响

1．3．5 胚胎生殖细胞的传代

1．3．6 胚胎生殖细胞的鉴定

1．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 常用试剂及配制

2．1．5 主要的生物信息学网站及分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 猪生殖嵴组织学切片制作

2．2．2 苏木素-伊红染色

2．2．3 组织切片免疫荧光

2．2．4 猪原始生殖细胞的分离

2．2．5 Realtime PCR

2．2．6 亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析

2．2．7 胚胎生殖细胞培养用饲养层的制备

2．2．8 胚胎生殖细胞的原代培养

2．2．9 胚胎生殖细胞的传代培养

2．2．10 猪胚胎生殖细胞的鉴定

3 结果与分析

3．1 猪生殖嵴形态变化及原始生殖细胞跟踪

3．1．1 猪生殖嵴形态变化跟踪

3．1．2 猪原始生殖细胞在体内迁移跟踪

3．2 猪原始生殖细胞印记基因表达的变化

3．2．1 Realtime PCR反应的特异性

3．2．2 印记基因的表达

3．3 猪原始生殖细胞印记基因甲基化的变化

3．3．1 IGF2基因的甲基化

3．3．2 H19基因的甲基化

3．4 猪胚胎生殖细胞的培养

3．4．1 饲养层细胞的形态特征

3．4．2 胚胎生殖细胞的形态特征

3．4．3 不同胚胎日龄对胚胎生殖细胞培养的影响

3．4．4 不同来源饲养层对胚胎生殖细胞培养的影响

3．4．5 不同传代方式对胚胎生殖细胞培养的影响

3．4．6 胚胎生殖细胞的鉴定

4 讨论

4．1 猪原始生殖细胞的迁移

4．1．1 生殖嵴的形成

4．1．2 原始生殖细胞的迁移

4．2 印记基因的研究

4．2．1 DNA甲基化与基因表达

4．2．2 印记基因的甲基化

4．3 胚胎生殖细胞培养的影响因素

4．3．1 饲养层细胞对胚胎生殖细胞培养的影响

4．3．2 胚胎日龄对胚胎生殖细胞培养的影响

4．3．3 胚胎生殖细胞的定向诱导分化

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士期间发表的学术论文