自噬在异氟醚致幼龄大鼠海马神经元凋亡中的作用

摘要

异氟醚是临床常用的吸入麻醉剂，越来越多的研究发现异氟醚可诱发快速生长发育期动物的大脑神经元异常凋亡，并伴随有脑功能的长期损害。本课题组多年来一直致力于异氟醚神经毒性方面的研究，在异氟醚引发幼鼠行为学改变、诱导神经细胞凋亡等方面获得了较多的实验数据。近期又发现异氟醚在诱导细胞凋亡的同时伴有自噬现象发生。自噬和凋亡的复杂关系是当今研究领域的一个热点问题，明确自噬在异氟醚诱导的神经细胞凋亡中的作用及相关机制，将为进一步探讨麻醉毒性及其机制提供理论基础。因此本试验以7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象，结合自噬工具药的运用，明确自噬在异氟醚致幼鼠海马凋亡中的作用，并初步探讨异氟醚引起的凋亡与自噬之间的关系。
　　试验选取120只7日龄SD大鼠，随机分为异氟醚(Isoflurane)麻醉组(ISO)、雷帕霉素(rapamycin，RAP)干预组（ISO+RAP）和3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)干预组(ISO+3-MA)。ISO+RAP组和ISO+3-MA组在麻醉前30 min分别腹腔注射20 mg/kg RAP和20 mg/kg3-MA。各组大鼠分别吸入1.5％异氟醚混合60％氧气0 h(CON)、2h、3h、4h和6h，CON组只吸入60％氧气6h。采用苏木精-伊红(HE)染色、原位末端标记法(TUNEL)染色、免疫组化和蛋白印迹法(Western blot)等技术，从组织学和分子学角度探讨异氟醚诱导的自噬和凋亡之间的关系。试验结果如下:
　　HE染色发现，对照组海马各区神经细胞元排列紧密，少有凋亡;ISO组在麻醉3h后出现较明显凋亡;ISO+RAP组在麻醉4h后出现较明显凋亡;ISO+3-MA组在各麻醉时间点均出现不同程度凋亡，在麻醉4h和6h时尤为严重。TUNEL染色显示:与对照组比，ISO组在麻醉3h后凋亡明显增加;ISO+3-MA组在麻醉2h后均有明显凋亡;ISO+RAP组仅在麻醉4h和6h时有明显凋亡。组间比较，ISO+RAP组在麻醉4h（P＜0.05）和6h(P＜0.05)时较ISO组细胞凋亡率显著降低;ISO+3-MA组在麻醉2h(P＜0.05)、3h(P＜0.05)和4h(P＜0.05)时较ISO组细胞凋亡率显著增多。Cleaved-caspase-3蛋白印迹结果与TUNEL染色结果基本一致。LC-3Ⅱ免疫组化显示:与对照组相比，ISO组在麻醉3h时阳性细胞比率较多;ISO+3-MA组LC-3Ⅱ阳性细胞比率较低，但在麻醉6h时明显增加;ISO+RAP组则在麻醉3h和4h时有较多阳性细胞表达。LC-3Ⅱ蛋白结果显示:与对照组相比，ISO组在麻醉3h后表达量显著增加;ISO+3-MA组在各麻醉时间点均无显著变化;ISO+RAP组在麻醉2h、3h和4h时显著升高。组间比较，ISO+RAP组在麻醉2h时表达量明显高于ISO组(P＜0.05)，在麻醉2h(P＜0.05)和3h(P＜0.05)时显著高于ISO+3-MA组。Beclin-1变化趋势与LC-3Ⅱ基本一致。Bcl-2蛋白印迹结果显示:与对照组相比，ISO组和ISO+3-MA组在麻醉3h后均有显著下降;ISO+RAP组仅在麻醉4h和6h时显著下降。组间相比，ISO组和ISO+3-MA组在麻醉3h(P＜0.05，P＜0.05)，4h(P＜0.05，P＜0.05)和6h(P＜0.05，P＜0.05)时均显著低于ISO+RAP组;在麻醉2h时，ISO+3-MA组Bcl-2表达量显著低于ISO+RAP组(P＜0.05)和ISO组(P＜0.05)。
　　本试验结果显示，1.5％异氟醚可诱发7日龄SD大鼠海马神经元发生自噬和凋亡，且自噬的出现早于凋亡。异氟醚诱导的神经细胞自噬对细胞凋亡有抑制作用，即异氟醚诱导的海马神经元自噬可降低其神经毒性，起到保护细胞作用。抑制自噬能加重异氟醚诱导的幼鼠海马神经元凋亡，而促进自噬能减轻异氟醚诱导的幼鼠海马神经元凋亡。

目录

声明

摘要

1 前言

1．2 吸入麻醉药神经毒性

1．2．1 吸入麻醉药神经毒性研究进展

1．2．2 吸入麻醉药神经毒性机制

1．3 细胞自噬概述

1．3．1 自噬的发生过程

1．3．2 自噬的调控机制

1．4 麻醉与自噬的关系

1．5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要试剂和药品

2．1．3 试验主要试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 试验动物

2．2．2 试验模型建立和样品采集

2．2．3 脑组织石蜡包埋与切片

2．2．4 苏木精-伊红(HE)染色观察海马组织形态学变化

2．2．5 TUNEL法检测海马神经细胞凋亡

2．2．6 免疫组化检测海马细胞自噬蛋白LC-3 Ⅱ的表达

2．2．7 Western blot检测自噬与凋亡相关蛋白的变化

2．3 数据处理

3 结果

3．1 海马组织病理学检测结果

3．2 海马组织TUNEL染色结果

3．3 海马组织LC-3 Ⅱ免疫组化结果

3．4 海马组织自噬与凋亡相关蛋白表达结果

4 讨论

4．1 试验的可行性和创新性

4．2 异氟醚导致幼龄大鼠海马细胞凋亡及自噬

4．3 自噬在异氟醚致海马神经元凋亡中的作用

4．3．1 抑制自噬对异氟醚致海马神经元凋亡中的作用

4．3．2 促进自噬对异氟醚致海马神经元凋亡中的作用

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文