从PTEN-PI3K-AKT信号通路探讨补肾疏肝方含药血清抑制人肺腺癌A549细胞增殖和转移的机制

摘要

背景及目的：
　　大城市大气严重污染和人口老龄化使我国肺癌发病风险逐渐上升；目前肺癌发病率和死亡率据国内恶性肿瘤首位。80％以上肺癌患者发现时已属于晚期肺癌，绝大多数已经失去手术的机会。肺癌组织类型主要包括小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。NSCLC主要包括肺腺癌和鳞癌。肺腺癌是最常见的组织亚型，占据NSCLC50%以上。随着科学研究成果逐渐用于临床，肺癌的组织分型逐渐过渡到分子分型，且肺癌的治疗越来越个体化、毒副作用越来越小、生存期越来越长。目前肺癌常用的治疗手段：手术、放化疗、介入、生物治疗（包括靶向治疗、过继细胞免疫治疗、细胞因子治疗等）等。不可忽略的是中医药在肺癌辅助治疗发挥重要作用：抗肿瘤、增敏放化疗和抑制耐药、提高患者生存质量、延长生存期等。中西医结合治疗肺癌获得更好效果。以扶正为主的中药是中医药治疗肺癌等恶性肿瘤主要用药。研究发现，从肾论治肺癌，取得很好效果：不仅能增强机体免疫力，抑制肺癌的增殖、转移及复发，还能提高生活质量，延长生存期。既往研究，补肾疏肝方有抗肺癌、使化疗增效、抑制转移、提高免疫力的作用。本实验通过MTT实验观察补肾疏肝方含药血清对肺癌A549细胞增殖；三维培养观察其对血管生成拟态的影响；RT-PCR实验观察其对PTEN-PI3K-AKT信号通路上的AKT-1、CyclinD1、NF-κB mRNA表达的影响；western blot实验观察其对PTEN-PI3K-AKT信号通路上的PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白的表达影响。进一步研究补肾疏肝方抑制肺腺癌细胞增殖和转移的作用机制。为临床合理应用补肾疏肝方提供理论依据和实验依据。
　　方法：
　　雄性SD大鼠120只随机分为6组，平均每组分配20只，并检测到每组体重的方差齐，即每组体重无差异，平均约250g。分别将各组命名为生理盐水组（对照组简称S组）：2mL生理盐水d1-d5每天两次灌胃；顺铂组（P组）：顺铂4mL8mg·kg-1于d1、d3、d5每天腹腔注射一次，低剂量补肾疏肝方组（L组）：2mL补肾疏肝方15g·kg-1的剂量于d1至d5每天两次药液灌胃；高剂量补肾疏肝方组（H组）：2mL补肾疏肝方30g·kg-1的剂量于d1至d5每天两次药液灌胃；低剂量联合顺铂组（C1组）：2mL补肾疏肝方15g·kg-1的剂量于d1至d5每天两次药液灌胃+顺铂4mL8mg·kg-1于d1、d3、d5每天腹腔注射1次，高剂量联合顺铂组（简称C2组）：2mL补肾疏肝方30g·kg-1的剂量于d1至d5天每天两次药液灌胃+顺铂4mL8mg·kg-1于d1、d3、d5腹腔注射每天腹腔注射1次）。中药熬制过程：将补肾疏肝方所有中草药于砂锅内用清水浸泡30分钟。浸泡后，水面要高过中草药约2-3cm，在大火煮开后用小火熬制30分钟。低剂量和高剂量补肾疏肝方汤药分别为常规熬制得到补肾疏肝方剂量的5倍和10倍的浓缩，以防中药体积太大，而不能有效的将所需药量全部灌入大鼠胃腔内。每只给予中药的大鼠大约每天给予中药2mL，每天2次，共5d。S组予同等量的生理盐水每天两次灌胃。末次灌胃和腹腔注射2h后水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下分离腹主动脉，并用头皮针采血，分离血清，56℃灭活30min，经0.22μm过滤除菌，-20℃保存。MTT实验观察对补肾疏肝方含药血清对肺癌A549细胞抑制率、血管生成拟态的影响；RT-PCR实验检测补肾疏肝方含药血清对A549细胞PTEN-PI3K-AKT信号通路上及信号通路下游的AKT-1、CyclinD-1、NF-κBmRNA表达的影响；Western blot实验检测补肾疏肝含药血清对A549肺腺癌细胞PTEN-PI3K-AKT信号通路上的PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白表达的影响。
　　结果：
　　1.低剂量补肾疏肝方组与低剂量联合顺铂组在48h、72h、96h的抑制率均高于其他实验组（p<0.05，p<0.01）；在给药24h、48h、72h、96h时，低剂量联合顺铂组的抑制率均高于其他实验组（p<0.05）；在24h、48h、72h、96h，高剂量补肾疏肝方组、高剂量联合顺铂组与顺铂组的抑制率两两比较均无统计学意义（p>0.05）.
　　2.各实验组的血管生成拟态的数目明显低于对照组的（p<0.05）；其中低剂量补肾疏肝方组与低剂量联合顺铂组的血管生成拟态的数目均明显低于其它组的（p<0.05，p<0.01）；低剂量联合顺铂组的血管生成拟态的数目明显低于其他组的；顺铂组、高剂量补肾疏肝方组、高剂量联合顺铂组的三组两两比较均无统计学意义（p>0.05）。
　　3.各实验组的AKT1、CyclinD1、NF-κB mRNA相对表达均低于对照组的（p<0.05）。低剂量补肾疏肝方组与低剂量联合顺铂组含药血清对A549肺腺癌细胞的AKT1、CyclinD1、NF-κB mRNA相对表达均低于其他组的（p<0.05， p<0.01），且低剂量联合顺铂组的相对表达均低于低剂量补肾疏肝方组（p<0.01），顺铂组、高剂量补肾疏肝方组、高剂量联合顺铂组三组的AKT1、CyclinD1、NF-κB mRNA相对表达两两比较均无统计学意义（p>0.05）。
　　4.各实验组的PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达均与对照组的明显不同（p<0.05）。低剂量补肾疏肝方组与低剂量联合顺铂组含药血清对A549肺腺癌细胞的PTEN蛋白相对表达均高于其他组的（p<0.05），而以上两组p-PI3K、p-AKT的相对表达均低于其他组的（p<0.05），且低剂量联合顺铂组的相对表达均明显不同与低剂量补肾疏肝方组的（p<0.01）；顺铂组、高剂量补肾疏肝方组、高剂量联合顺铂组三组的PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达比较均无统计学意义（p>0.05）。
　　结论：
　　低、高剂量补肾疏肝方均能抑制肺腺癌A549细胞的增殖、血管生成拟态，可能通过PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制细胞增殖和转移；适当剂量的补肾疏肝方与顺铂有协同作用。

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缩略词表

前言

材料与方法

1.实验材料

2 方法与步骤

实验结果

1 补肾疏肝方含药血清对A549细胞增殖的影响

2 补肾疏肝方含药血清对A549细胞三维培养血管生成拟态的影响

3补肾疏肝方含药血清对A549细胞AKT-1、CyclinD1、NF-κB mRNA相对表达的影响

4 补肾疏肝方含药血清对A549细胞PTEN、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达的影响

讨论

1 含药血清的制备和体外细胞培养为中药方剂研究提供了实验基础

2 补肾疏肝方含药血清抑制A549肺腺癌细胞增殖的分析

3 补肾疏肝方含药血清抑制A549细胞血管生成拟态的分析

4 补肾疏肝方含药血清调节A549细胞PTEN-PI3K-AKT信号通路的分析

5 中西医结合理论角度讨论补肾疏肝方的作用机制

6 问题与展望

结论

参考文献

综述： 肺癌和免疫系统的PTEN-PI3K-AKT信号通路

个人简历及在校期间发表论文

致谢