miR-200c对三阴性乳腺癌细胞系上皮间质转化的影响

摘要

研究背景:乳腺癌是女性最常见的恶性、高度异质性肿瘤之一。根据2011年 St.Gallen国际会议共识，乳腺癌被分为腔管A型、腔管B型、HER2过表达型和基底样型乳腺癌(BLBC)。BLBC因ER阴性、PgR阴性、HER2阴性，属于三阴性乳腺癌（TNBC）范畴，在临床不能应用内分泌治疗，且抗HER2治疗无效，主要治疗手段是化疗，因此寻找有效针对三阴性乳腺癌的治疗靶点，对乳腺癌进行个体化治疗是目前临床研究乳腺癌的重要方向。
　　上皮-间质转化(EMT)是使具有极性的上皮细胞经过多个生物化学改变，获得间质细胞表型的生物学过程。从启动至完成EMT涉及多个分子生物过程，如转录因子的激活、细胞骨架蛋白的重组和表达、细胞外基质降解酶的产生以及特定miRNA的表达等。上述分子生物学的改变将导致细胞内与细胞间的特征发生一系列变化，主要表现为上皮细胞失去极性，与上皮细胞相互作用的基底膜降解，间质样细胞形成并从其起源的上皮层迁移。正常情况下，EMT是机体胚胎发育以及机体修复受伤组织的重要调控机制，病理情况下，EMT则是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。
　　Snail-2（Slug）是EMT的重要转录因子之一，可通过多种途径调节EMT。E-cadherin是一种细胞粘附分子，可阻止细胞移动、侵袭和转移，抑制 EMT的发生，E-cadherin丢失是EMT发生的最主要特征。已经证实，Slug可通过结合E-cadherin基因启动子的E盒而直接抑制其表达，进而导致EMT的发生。
　　miRNA是一类长约22-25nt的非编码 RNA，可与 mRNA的3’非翻译区（3’UTR）结合，负向调控 mRNA。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，均可抑制EMT，降低癌细胞转移能力，属于肿瘤抑制性miRNA。miR-200c可通过靶向结合ZEB1、ZEB2、HMGB1和Pin1等因子调节乳腺癌细胞EMT过程，表明miR-200c在调节乳腺癌浸润、侵袭、转移中发挥重要作用，是目前研究乳腺癌EMT的热点。
　　Liu、Fu等分别在人前列腺癌细胞系和恶性胶母质瘤细胞中发现，miR-200c可通过靶向下调 Slug进而抑制 EMT过程。本课题组前期通过基因分析预测miR-200c可以与Slug结合，并以三阴性BT549细胞为研究对象，通过RT-PCR和Western Blot等技术检测Slug和E-cadherin在mRNA及蛋白水平的表达情况，采用侵袭实验和划痕实验检测BT549转染miR-200c后侵袭、迁移能力的变化情况，表明miR-200c在BT549中可通过抑制Slug的表达进而提升E-cadherin的表达，抑制细胞迁移。而2015年St Gallen早期乳腺癌国际专家共识指出，三阴性乳腺癌之间仍存在较大异质性，部分三阴性乳腺癌对化疗敏感，预后较好；另一部分则对同样的化疗方案高度耐药。至本研究开题时，仅有本课题组前期对三阴性细胞系BT549转染miR-200c用于研究Slug调控EMT机制的报道，由于乳腺癌是一种高度异质性疾病，在其它乳腺癌细胞系中miR-200c是否通过上述途径调控EMT尚未见报道。
　　目的:本研究选用三阴性细胞系（BT549、MDA-MB-231）和非三阴性细胞系（腔管 A型的MCF-7、HER2过表达型的SK-BR-3），对两组细胞系转染 miR-200c模拟物及其阴性对照物，检测Slug和E-cadherin在mRNA、蛋白水平的表达变化情况，观察 miR-200c对三阴性细胞系迁移能力的影响情况，探讨 miR-200c对三阴性乳腺癌EMT的调节作用，以期为临床诊治三阴性乳腺癌提供新的靶标。
　　材料和方法:
　　1.研究对象和分组:选择三阴性乳腺癌细胞系BT549和MDA-MB-231，腔管A型乳腺癌细胞系MCF-7，HER2过表达型SK-BR-3为研究对象。所有细胞均用RPMI-1640完全培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养。各细胞系按转染物质不同分为：miR-200c模拟物/Lipo2000组（A组）、miR-200c阴性对照物/Lipo2000组（B组）、miRNA阴性对照物/Lipo2000组（C组），终浓度均为50 nM，同时设置转染等量Lipo2000的组别为试剂对照组（D组），未处理组为空白对照组（E组）。
　　2.实验方法
　　2.1细胞培养及转染四个细胞系均用RPMI-1640完全培养基培养，培养条件为37℃、5%CO2湿润环境。在细胞处于对数期时，将细胞按一定数量接种于六孔板，常规培养24h后，对每个细胞系按分组不同，在六孔板中分别转染不同物质后进行培养，待细胞铺孔底95%以上时，进行后续操作。
　　2.2总RNA提取以及RT-PCR提取各组细胞的总RNA，反转录为cDNA。设计并合成 GAPDH、Slug和E-cadherin基因的上、下游引物，检测各组细胞转染miR-200c模拟物及其阴性对照物后Slug和E-cadherin在mRNA水平的表达情况。2.3总蛋白提取以及 Western Blot提取各组细胞的总蛋白，用以检测各组细胞转染miR-200c模拟物及其阴性对照后Slug和E-cadherin在蛋白水平的表达情况。2.4划痕实验将BT549和MDA-MB-231均匀接种于六孔板中，培养约24 h后，对细胞进行转染处理，更换不含抗体培养基继续培养约36-48 h后，用高压灭菌的200μl枪头对各组细胞划平行直线，用以检测miR-200c对三阴性乳腺癌细胞系迁移能力的影响。
　　3.统计学分析:应用SPSS19.0软件进行统计学分析。对于计量资料，用x±s表示，各株细胞系间比较和细胞系内各处理组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
　　结果:
　　1.细胞选择:选择每个细胞系对数期的细胞进行消化，并接种于六孔板。根据实验设计，对BT549和MDA-MB-231，选用1×105/孔的浓度将细胞接种于六孔板以进行后续试验；对MCF-7和SK-BR-3，则选用3×105/孔的浓度
　　2.空白对照组Slug、E-cadherin的mRNA和蛋白表达量:三阴性细胞系与非三阴性细胞系相比，空白对照组Slug、E-cadherin在mRNA与蛋白水平的表达量差异具有统计学意义。
　　3.miR-200c对两组细胞系Slug、E-cadherin的影响:转染miR-200c后，三阴性细胞系Slug在mRNA和蛋白水平表达量均明显降低，E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达量均明显增高。
　　4.miR-200c对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响:转染 miR-200c模拟物组的划痕宽度恢复率随时间的延长愈显低于其他组，尤其在36 h时细胞迁移能力明显下降。
　　结论:miR-200c仅在TNBC细胞系中发挥下调Slug、提高E-cadherin表达，进而抑制EMT的作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略词对照表

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 各细胞系生长曲线

3.2 Real-Time PCR熔解曲线图

3.3空白对照组Slug、E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达量

3.4 miR-200c对两组细胞系Slug、E-cadherin的影响

3.5 miR-200c对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响

4 讨论

4.1 乳腺癌是一类高度异质性的癌症

4.2 TNBC与BLBC的关系

4.3 EMT及其调节因子可作为治疗TNBC的靶标

4.4 miR-200c可抑制TNBC细胞迁移

4.5 miR-200c与Slug、E-cadherin的关系

5 结论

6 创新点

参考文献

综述: miRNA与三阴性乳腺癌关系的研究进展

1 乳腺癌

2 TNBC

3 miRNA

4 miRNA与TNBC

5 结论

参考文献

个人简介及攻读硕士学位期间发表的文章

1. 基本情况

2. 研究生期间发表论文

3. 参与科研项目

致谢