TET2缺失导致红系祖细胞功能异常的机制研究

摘要

背景和目的： 红细胞生成指造血干细胞在造血微环境中，通过细胞的自我更新、增殖、定向分化和脱核等重要的生物学事件，最终产生成熟红细胞的过程。由于红细胞生成紊乱或无效造血而引起的贫血是多种人类血液病重要的临床表现，其中包括骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndromes，MDSs）。MDSs是造血干祖细胞克隆发生异常的髓系疾病，主要特征是骨髓造血功能缺陷和髓内细胞凋亡。而MDSs患者突变频率最高的的基因是DNA双加氧酶2（Ten-Eleven-Translocation2，TET2），其功能是把5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）转变为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcyosine，5-hmC），从而参与DNA去甲基化过程，影响靶基因转录和表达。目前，关于TET2突变MDSs患者的红系异常的分子机制仍不清楚。本课题组已报道，TET2敲低引起c-Kit和AXL介导的红系祖细胞的克隆性增殖，从而出现功能异常Marker-CFU-E（M-CFU-E）细胞。进一步研究发现M-CFU-E细胞不仅异常增殖，也发生大量的凋亡。因此，本研究主要是在体外红系培养发育体系以及血液肿瘤细胞系中敲低TET2的表达，以期揭示TET2调控红系祖细胞凋亡的分子机制，为TET2突变的MDSs疾病相关的凋亡机制提供新的视角，也为治疗MDSs疾病提供新的科学依据。 方法： 首先，选用CD34+磁珠在脐带血的单个核细胞中分离纯度为95%以上的造血干细胞CD34+，转染携带TET2-shRNA的慢病毒，采用嘌呤霉素（Puromycin）进行筛选，利用qRT-PCR方法，检测TET2敲低效率并成功获得TET2敲低细胞。在体外红系培养体系中，运用流式细胞技术分选出正常组和TET2敲低组红系祖细胞之后，通过流式细胞分析技术检测两组细胞分化和凋亡，通过甩片观察其形态。 其次，为明确其相关凋亡分子，分选出Luciferase CFU-E和M-CFU-E两组细胞，进行转录组测序（RNA-seq），运用生物信息分析的方法，明确TET2敲低后的差异基因和凋亡相关信号通路；为了验证其表达差异，运用qRT-PCR和流式细胞技术同时检测了TET2敲低型细胞中凋亡相关分子（FAS，Fas Cell Surface Death Receptor）的表达。为进一步探讨TET2敲低引起FAS上调的分子机制，通过糖基化和限制性内切酶的处理方式，检测并分析FAS启动子区关键CCGG位点的5-mC和5-hmC的差异性。同时，选用FAS的下游通路中Caspase3特异性抑制剂（Z-DEVD-FMK）进一步验证其凋亡通路。不仅如此，还分选出健康人与TET2突变的MDSs患者骨髓中的造血干细胞，在体外向红系定向分化，检测TET2突变对细胞凋亡和FAS表达的影响。 最后，由于TET2突变参与了多种血液肿瘤的发生，因此，在红白血病细胞系K562中敲低TET2的表达，检测TET2表达下降对K562细胞增殖及凋亡的影响。同时，在K562细胞中过表达FAS，检测其对增殖和凋亡的影响。研究结果： 为了探究TET2在红系祖细胞发育过程中发挥的功能，首先验证了感染TET2-shRNA的CD34+细胞的敲低效率，结果显示，实验组TET2的表达水平大约是对照组TET2的表达水平的40%。在有效敲低TET2的基础上，进一步分选出TET2-CFU-E，且在体外红系发育培养体系中继续培养，发现TET2有效敲低后，其分化受阻。为了探究分化受阻的细胞相关的表型，分选出功能异常的细胞（M-CFU-E），继续用红系培养体系培养，发现其凋亡显著增加。 其次，为明确其相关凋亡分子，通过RNA-seq测序分析，结果显示Luciferase CFU-E和M-CFU-E之间有多达400个差异基因，含25个与凋亡相关信号通路相关的基因，其中16个表达上调，有FAS、NCKAP1和TNFRSF10B等，其表达显著上调。通过qRT-PCR和流式检测进一步验证FAS的表达，结果显示与Luciferase CFU-E相比，TET2-CFU-E细胞FAS表达不变，而M-CFU-E细胞中表达上调。为了探讨TET2敲低引起FAS上调的机制，检测将上述三组细胞进行FAS启动子区关键CCGG位点（-305，-251，-136，-90）5-mC和5-hmC检测，结果显示，与Luciferase CFU-E相比，TET2-CFU-E和M-CFU-E细胞中FAS关键CCGG位点的5-mC和5-hmC并没有发生改变，因此FAS的表达可能不直接受TET2调控，TET2和FAS之间还存在其他的靶基因来相互调控基因的表达。为了进一步探究TET2缺失是否通过调控FAS下游信号分子Caspase3引起凋亡，因此，选用TET2敲低后分选出的M-CFU-E进行挽救实验，结果显示，与Luciferase CFU-E相比，Caspase3特异性抑制剂（Z-DEVD-FMK）不能回复M-CFU-E细胞的凋亡，这表明TET2敲低后红系早期祖细胞产生的凋亡并不依赖于Caspase3凋亡的通路。与此同时，发现与健康人相比，TET2突变的MDSs患者骨髓细胞的造血干细胞在红系发育分化的第11天和13天其凋亡显著增加，同时，FAS的表达在从11天到17天均上调。 最后，由于高风险性向白血病转化是MDSs疾病的重要特征，而细胞凋亡在MDSs的发生和演变的过程中扮演重要角色。为了探讨TET2调控的细胞凋亡在MDSs的演变中的功能，首先比较健康人骨髓细胞与血液肿瘤细胞K562中的TET2和FAS的表达水平，结果显示，TET2在K562细胞中的表达为健康人骨髓细胞的一半，并且FAS在K562细胞中不表达。为进一步明确TET2在K562细胞中的功能，首先得到TET2敲低的K562细胞，随后利用Hemin诱导其向红系分化，结果显示，与对照组相比，TET2敲低促进细胞增殖，但不影响细胞凋亡，同时FAS的表达也没有改变。进一步在K562细胞中过表达FAS，结果显示，高水平的FAS能够促进K562细胞的凋亡从而抑制其增殖。这表明，FAS的表达水平可能是TET2突变的MDSs疾病是否发生演变的重要调控分子，FAS及其下游信号通路可能作为潜在的药物靶点治疗血液肿瘤。 结论： 综上所述，本论文探究了TET2在红系祖细胞阶段的重要功能：TET2敲低产生功能异常的M-CFU-E，其分化受阻、凋亡增加以及死亡受体FAS表达上调。TET2敲低不引起FAS启动子区关键位点甲基化和去甲基化的改变，因此，TET2可能间接调控FAS的表达。TET2敲低诱导的细胞凋亡不依赖Caspase3通路。与此同时，TET2突变的MDSs患者的骨髓细胞也伴随大量凋亡，并且FAS的表达显著上调。不仅如此，TET2敲低还能促进血液肿瘤细胞系K562增殖，但不影响其凋亡。而过表达FAS却能促进K562细胞的大量凋亡。因此，FAS的表达水平可能作为TET2突变导致的MDSs疾病能否转变为白血病的重要标志。通过本论文的研究，为TET2突变的MDSs疾病相关的凋亡机制提供新的视角，也为治疗MDSs疾病提供新的科学依据。

目录

声明

中英文缩略词

第一章 引言

1.1 红系发育概论

1.1.1 红系发育

1.1.2 红系发育调控

1.1.3 红系发育异常性疾病

1.2 TET2研究进展

1.2.1 TET2基因简介

1.2.2 红系发育中TET2研究进展

1.2.3 MDSs疾病高频突变基因TET2

1.2.4 MDSs与凋亡

1.3 FAS研究进展

1.3.1 FAS基因简介

1.3.2 红系相关FAS研究进展

1.4 研究内容、目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 所用细胞

2.1.2 主要试剂及所用耗材

2.1.3 所用的质粒、引物和实验试剂配制

2.1.4 主要仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 TET2敲低型载体质粒的扩增与提取

2.2.2 慢病毒的包装、浓缩及滴度检测

2.2.3 分离纯化人脐带血中CD34+细胞

2.2.4 转染CD34+细胞2.2.4.1 转染CD34+细胞

2.2.5 5-mC和5-hmC水平的检测

2.2.6 统计学分析

第三章 TET2调控红系祖细胞凋亡机制的探讨

3.1 实验结果

3.1.1 TET2敲低导致功能异常的红系祖细胞M-CFU-E的凋亡增加

3.1.2 TET2敲低导致M-CFU-E细胞凋亡相关基因发生改变

3.1.3 TET2敲低导致M-CFU-E细胞FAS表达上调

3.1.4 TET2敲低不改变FAS启动子区关键CpG岛的甲基化水平

3.1.5TET2敲低产生的凋亡不依赖Caspase 3信号通路

3.1.6 TET2突变的MDSs患者中凋亡增加和FAS上调

3.2 讨论

3.3 实验小结

第四章 初步探索TET2在血液肿瘤细胞中的功能

4.1 实验结果

4.1.1 TET2和FAS在健康人骨髓以及K652细胞中的表达情况

4.1.2 TET2敲低促进K562细胞的增殖

4.1.3 TET2敲低对K562细胞的凋亡没有影响，FAS表达也不改变

4.1.4 过表达FAS抑制K562细胞的增殖，促进其凋亡

4.2 讨论

4.3 实验小结

第五章 全文结论与展望

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与科研成果

致谢