禽（鸡）呼肠孤病毒σB编码基因的原核表达及重组抗原ELISA诊断试剂盒的研制

摘要

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属的成员之一。ARV在临床上主要引起鸡的关节炎/腱鞘炎。其造成患鸡生长抑制、免疫功能降低、继发感染增加等，给养鸡业带来严重的经济损失。ARV共编码15个蛋白，其中σ B蛋白是由S3基因编码，是病毒的外壳蛋白之一，具有提高感染细胞的能力，并在病毒的致病机理上起着一定的作用。本试验利用基因克隆技术体外表达σB蛋白并应用表达的融合蛋白作为抗原建立ELISA检测技术。 根据GenBank中已发表的ARVσB序列，设计合成了一对特异性引物，对ARV 99G株的S3基因进行PCR扩增，扩增一段1100bp的基因片断，然后克隆到表达载体pGEX-6p-1中。将重组质粒转化到表达宿主菌，经终浓度为1 mmol/L的1PTG诱导，高效表达了σB蛋白。经Western-blot检测表明，表达的融合蛋白能够被ARV的阳性血清所识别，具有良好的抗原性。 用纯化后的原核表达的ARVσB蛋白作为诊断抗原，建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法，并对ELISA的反应条件进行了探索，确定了抗原的最适包被浓度为5μg/mL，检测血清稀释液为100倍稀释，血清与抗原反应最佳反应时间为1小时，酶标二抗最佳作用时间为1小时，底物的最佳显色时间为15分钟。批内重复试验，变异系数小于10％；批间重复试验，变异系数小于15％，说明具有很好的重复性。用此方法检测包被的抗原不与NDV,AI，IBDV等阳性血清发生交叉反应，表明建立的ELISA诊断方法，具有很好的特异性。应用建立的ELISA方法对98份临床血清进行检测，结果与进口试剂盒的符合率为94％，表明该方法具有很好的临床使用价值。 本研究成功的将σB编码基因克隆到pGEX-6p-1载体上，转入E.coli BL21(DE3)中，表达了σB蛋白，应用表达的蛋白作为抗原建立了ARV的ELISA诊断方法。ARV重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制，为免疫鸡群抗体监测和进行ARV流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1 ARV的生物学特性

1.2 ARV诊断方法研究

1.3 ARV的免疫预防

1.4研究的目的和意义

1.5研究内容和方法

第二章ARVσB编码基因的原核表达

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

第三章ARV间接ELISA诊断方法建立及试剂盒的组装

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

第四章结论

参考文献

致谢

附 录

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