蛋氨酸对抗和保护化疗药物引起的内耳毛细胞损伤和死亡作用的研究

摘要

目的：随着副作用小、稳定性好的Ⅱ、Ⅲ代抗肿瘤药物铂类制剂的出现，顺铂在化疗当中的地位有所下降，但是对睾丸精原细胞瘤、卵巢肿瘤晚期等生殖系统肿瘤的治疗以及肿瘤的联合化疗上具有无可替代的优势，但是由于顺铂是一种浓度决定疗效的抗肿瘤药物，随着给药浓度的升高，引发了耳毒性、肾毒性及神经毒性等毒性副作用的出现。顺铂引起的耳毒性病变部位多位于耳蜗底转、中转的Corti氏器的外毛细胞，临床表现为耳鸣、耳聋，听力损失多在4000Hz-8000Hz的高频区。顺铂引起的听力损伤通常发生在高频且与剂量相关。研究发现顺铂可以损伤耳蜗的螺旋器和螺旋神经节细胞，而且可以使动物模型的耳蜗内电位降低，复合动作电位和耳蜗微音电位阈值增高。顺铂引起的毒性机制目前有5种假说，它包括氧化应激产生的活性氧簇妨碍了抗氧化防御系统、顺铂在内耳的蓄积、核苷酸受到抑制、内外淋巴间水及电解质的失调。本实验为了寻求有效的防治化疗药物耳毒性的途径，针对顺铂耳毒性的氧化应激产生的活性氧簇妨碍了抗氧化防御系统的这一重要发病机制，我们尝试通过用巯基化合物蛋氨酸对顺铂导致的耳毒性动物模型进行实验研究，期望从形态和功能上来证实抗氧化剂蛋氨酸对顺铂耳毒性的防治作用，为临床上化疗过程引起的耳毒性的预防提供参考和思路。
　　 方法：采用听性脑干反应和形态学的观察的方法，观察蛋氨酸对顺铂引起的内耳毛细胞损伤的保护作用。具体步骤如下：
　　 1.实验分组及模型制作：将30只昆明小鼠随机分为3组，每组10只(n=10)，顺铂组：给予顺铂3.5mg/kg/d进行腹腔注射，连续7天；顺铂十蛋氨酸组：先给予蛋氨酸300mg/kg/d腹腔注射，30min后给予顺铂3.5mg/kg/d进行腹腔注射，连续7天；对照组：生理盐水给予与顺铂组等容量的注射连续7天；在第8天进行听型脑干诱发电位的检测。然后小鼠在水合氯醛麻醉(400mg/Kg)下断头取出耳蜗，将标本在显微镜下进行解剖、染色、铺片等处理后，进行光镜的观察。
　　 2.听性脑干反应ABR的检测采用美国Nico-let公司questTM型诱发电位检测仪对小鼠的用药后的听功能进行测试。小鼠在腹腔注射水合氯醛(400mg/kg)麻醉后，将记录电极置于前额正中皮下，参考电极插于受试动物耳垂下，地极置于鼻尖，将耳机置于距外耳道口约1cm处，极间电阻＜5Ω。刺激声为0.10ms交替短声(click)，给予电位叠加平均1000次，扫描时间维持10ms，滤波范围是150-1500Hz，刺激重复率为11次/秒，刺激强度为20-l00dBSPL，开始时以10dB幅度行递减，然后以5dB的幅度递减，最终以能分辨出ABR波形的最低刺激强度确定最终阈值，每耳测3次，以波Ⅲ阈值作为判断ABR阈值的标准，并测量100dBpeSPL时Ⅰ波和Ⅲ波的潜伏期。
　　 3.光镜标本的制作及观察测试ABR后，在小鼠麻醉状态下立即断头并取出双侧内耳，在解剖显微镜下取下镫骨，挑开蜗窗和前庭窗膜，蜗尖钻孔，从蜗尖灌注10％福尔马林溶液并在4℃下在此溶液当中固定24h。固定的耳蜗经0.1mol/L的PBS液冲洗后用10％EDTA-Na2脱钙一周，每天更换脱钙液1次，而后经0.1mol/L的PBS液洗涤3次后，在解剖显微镜下进行耳蜗基底膜的剥离，全程取下耳蜗的基底膜，将基底膜进行分回截断铺片并HE染色，都铺放在载玻片上的甘油滴中，盖上盖玻片，周围用中性树胶封固。普通光学显微镜下观察。
　　 3.统计学处理：采用SASV8.0统计软件进行实验数据处理，所有计量资料数据以((?)±S)表示，计量资料先行正态性和方差齐性检验，再运用完全随机设计(completerandomizeddesign)单因素方差分析(one-factoranalysisofvariance)进行数据处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1ABR反应阈：对照组均值(32.143±3.934)dBpeSPL，顺铂组均值为(51.429±3.77963)dBpeSPL，蛋氨酸+顺铂组均值为(40.5±4.378)dBpeSPL;示对照组与顺铂组有差别，对照组与蛋氨酸加顺铂组有差别，顺铂组与蛋氨酸加顺铂组有差别；经过给予蛋氨酸能使ABR反应阈降低，但是比对照组要升高，其差异有统计学意义。(2)ABR波潜伏期：对照组的Ⅰ波的均值(1.3625±0.1144)ms，顺铂组的Ⅰ波的均值(2.09±0.5048)ms，蛋氨酸+顺铂组的Ⅰ波的均值(1.56±0.2026)ms;对照组的Ⅲ波的均值(3.1425±0.1267)ms，顺铂组的Ⅲ波的均值(3.86±0.3316)ms，蛋氨酸+顺铂组的Ⅲ波的均值(3.256±0.2492)ms，蛋氨酸可以使顺铂组在Ⅰ波和Ⅲ波的潜伏期均有明显的降低。
　　 2光镜观察：正常对照组动物耳蜗基底膜外毛细胞排列整齐，结构清晰，无变性、损坏。顺铂处理组基底膜外毛细胞底转、中转和项转有不同程度的坏死、脱落，尤以底转缺失严重。应用蛋氨酸保护的动物耳蜗毛细胞较未用蛋氨酸保护的顺铂组的动物耳蜗毛细胞损伤明显减轻，尤以底转和中转的保护作用明显。
　　 结论：本实验以自由基引起的氧化应激是顺铂引起耳毒性的这一重要机制为依据。蛋氨酸又是一种直接或间接的抗氧化剂，不像其他的氨基酸，它可以使氧化可逆，充当了一种自由基清除剂。所以，我们将蛋氨酸与化疗药物的耳毒性防治联系起来，期待从多层面不同角度证明蛋氨酸的防治作用。本实验从形态上，蛋氨酸可以对顺铂耳毒性的小鼠耳蜗基底膜底、中及顶转的毛细胞有不同程度的保护作用；在功能上，通过听力脑干反应的检测蛋氨酸可以使顺铂耳毒性小鼠的听阈和Ⅰ波、Ⅲ波的潜伏期降低，这与形态学上的表现一致；从而从两个方面证实了蛋氨酸对顺铂耳毒性的防治作用。此外，在临床上顺铂引起的耳毒性可以引起平衡失调，直接导致人眩晕并丧失行动能力，因而对前庭毒性的研究和耳蜗毒性前庭毒性之间的相互联系就成为我们此项课题今后的研究方向，同时也使得蛋氨酸的耳毒性防治作用从而扩展至前庭毒性的防治，使蛋氨酸耳毒性防治作用更加完善。

目录

文摘

英文文摘

蛋氨酸对抗和保护化疗药物引起的内耳毛细胞损伤和死亡作用的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 化疗药物顺铂耳毒性防治的研究进展

参考文献

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