二恶英暴露对在位子宫内膜组织中转化生长因子β2、孕激素受体以及基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-7表达影响的实验研究

摘要

目的：近年来子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)发病率逐渐增高，但其发病机制尚未完全阐明。目前有研究表明二恶英与EMs的发病有关系，但其促进子宫内膜异位症发生发展的机制尚未阐明，有研究提示二恶英可能通过影响在位子宫内膜组织正常的生物功能而诱发EMs的产生，胎儿期的二恶英暴露有可能增加成年期的患病风险，且二恶英的持续暴露可能促进EMs的发展。尚有研究报道TGF-β2、PR、MMP-3及MMP-7在维持正常的子宫内膜生物功能中发挥重要作用，本研究旨在检测不同时期不同剂量的二恶英暴露小鼠在子宫内膜异位症模型状态下在位子宫内膜组织转化生长因子β2(transforming growth factor，TGF-β2)，孕激素受体(progesterone receptor，PR)以及基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase，MMP-3)和基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase，MMP-7)表达，以探讨TCDD对子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)发病的影响及其机制。
　　 方法：
　　 1、动物模型的建立
　　 选择60只已孕无特殊病原体(specific pathogen free，SPF)级C57BL/6小鼠，其雌性子代在其不同的发育阶段(包括胎儿期，青春期，成年期)给予TCDD暴露，分为五组0/0，0/3，3/0，3/3，3/10(对照组，青春期+成年期暴露组，胎儿期+成年期暴露组，胎儿期+青春期+成年期暴露组，胎儿期+青春期+成年期高剂量暴露组)。并且在其生后第70天采用小鼠自体子宫内膜移植法建立小鼠子宫内膜异位症模型。术后3、6、9周各暴露一次TCDD3ug/kg。
　　 2、后期指标的检测
　　 建模术后12周将所有处理组的小鼠脱臼处死，取其在位子宫内膜组织，用免疫组化PV法和Western-blot方法检测TGF-β2、PR、MMP-3和MMP-7的表达并进行比较。
　　 3、所有数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，采用多个均数比较的方差分析，计数资料采用X2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、各组小鼠造模成功率的比较，采用行×列表的X2检验，对组间比较有显著差异的数据进行多个样本率间的多重比较。
　　 数据统计结果显示各组间皮下种植成功率差异无统计学意义(P>0.05)，各组间腹膜种植成功率差异有统计学意义(P<0.05)组间两两比较结果显示3/3组种植成功率显著高于0/0组(P<0.00625)。各组间卵巢部位异位种植成功率无显著差异(P>0.05)。0/0组中皮下、腹膜及卵巢异位种植成功率无显著差异(P>0.05)，0/3组中不同部位的异位种植成功率有显著差异(P<0.05)，不同部位两两比较发现皮下和腹膜，腹膜和卵巢部位的异位种植成功率无显著差异(P>0.0125；P<0.0125)，卵巢的异位种植成功率显著高于皮下(P<0.0125)。3/0组中皮下、腹膜及卵巢异位种植成功率具有显著性差异(P<0.05)经过组内不同部位种植成功率的两两比较发现皮下和腹膜的异位种植成功率无显著差异(P>0.0125)，皮下和卵巢的异位种植成功率有显著差异(P<0.0125)，腹膜和卵巢的异位种植成功率无显著差异(P>0.0125)3/3组中皮下、腹膜及卵巢部位的种植成功率有显著差异(P<0.05)，各部位种植成功率两两比较显示皮下与腹膜，腹膜与卵巢种植成功率无显著差异(P>0.0125；P>0.0125)，卵巢部位种植成功率显著高于皮下种植成功率(P<0.0125)，3/10组中皮下、腹膜及卵巢异位种植成功率有显著差异(P<0.05)，各部位两两比较显示皮下与腹膜，腹膜与卵巢的异位种植成功率无显著差异(P>0.0125；P>0.0125)，卵巢部位的异位种植成功率显著高于皮下种植成功率(P<0.0125)。研究还发现随暴露剂量的增加异位灶外观由小囊泡发展为大囊泡，内有大量液体积聚，表面张力较大腹腔组织粘连严重。(见附图2)
　　 2、各组小鼠在位子宫内膜中TGF-β2和PR的表达，两个指标在各组中的数据经方差齐性检验，符合方差分析的条件，采用完全随机设计资料的方差分析，各组数据经比较有显著差异的进行多个样本均数间的多重比较，采用LSD-t检验。
　　 PR及TGF-p2在0/0组与0/3组中的表达经比较无显著性差异(P>0.05，P>0.05)，PR及TGF-β2在0/0组与3/0组的表达经比较无显著性差异(P>0.05，P>0.05)，PR及TGF-β2在0/0组与3/3组的表达经比较具有显著性差异，(P<0.05，P<0.05)。其在3/10组中的表达低于3/3组中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 3、各组小鼠在位子宫内膜中MMP-3及MM-7的表达，两个指标在各组中的数据经方差齐性检验，符合方差分析的条件，采用完全随机设计资料的方差分析，各组数据经比较有显著差异的进行多个样本均数间的多重比较，采用LSD-t检验。
　　 MMP-3及MMP-7在0/0组与0/3组中的表达经比较差异无统计意义(P>0.05，P>0.05)。MMP-3及MMP-7在0/0组与3/0组中的表达经比较差异无统计意义(P>0.05，P>0.05)。MMP-3及MMP-7在0/0组中的表达显著低于3/3组及3/10组中的表达(P<0.05，P<0.05)，其在3/10组中的表达高于3/3组中的表达，差异有统计学意义((P<0.05，P<0.05)。
　　 结论：
　　 1、在不同时期及不同剂量的TCDD暴露组小鼠进行皮下、腹膜及卵巢部位的异位内膜种植后，3/3组(胎儿期+青春期+成年期普通剂量暴露组)的腹膜种植成功率明显高于0/0组(对照组即未暴露组)。在各个TCDD暴露组，与对照组不同的是卵巢部位的异位内膜种植成功率明显高于皮下种植的成功率。说明TCDD暴露可促进异位内膜的种植。
　　 2、3/10组(胎儿期+青春期+成年期高剂量TCDD暴露组)小鼠在位内膜组织中TGF-β2和PR的表达明显低于3/3组(胎儿期+青春期+成年期普通剂量暴露组)，而3/3组表达又明显低于0/0组(即对照组)，说明TCDD可下调在位内膜组织中TGF-β2和PR的表达，且下调作用随剂量的增加而逐渐增强。
　　 3、3/10组(胎儿期+青春期+成年期高剂量TCDD暴露组)小鼠在位内膜组织中MMP-3和MMP-7的表达明显高于3/3组(胎儿期+青春期+成年期普通剂量暴露组)，而3/3组表达又明显高于0/0组(即对照组)，说明TCDD可上调在位内膜组织中MMP-3和MMP-7的表达，且这种上调作用随剂量的增加而逐渐增强。
　　 4、胎儿期、青春期和成年期小鼠不同剂量的TCDD暴露可能通过改变在位子宫内膜的生物功能继而促进成年期小鼠子宫内膜异位症的发生。