Toll样受体4(TLR4)拮抗剂在大鼠颅脑创伤中的作用及对海马区神经元自噬调节的分子机制研究

摘要

创伤性脑损伤（Traumatic brain injury, TBI）是神经外科中最常见的疾病，也是中青年人群（<45岁）中最具威胁的致残、致死因素之一。TBI是以原发性损伤为基础而逐渐发展起来以继发性脑损伤为主的一系列复杂的分子级联事件的总和，最终导致脑组织水肿，神经元死亡，运动和认知功能受损的严重临床疾病。在继发性损害机制中包括，神经炎症反应、自由基的堆积、钙超载、线粒体功能障碍、细胞的凋亡等，然而证据表明 TBI后引发的无菌性神经炎症反应和神经元的过度自噬也作为加重脑损伤的重要因素，越来越多的受到研究者的关注。
　　TLR4是一类介导天然免疫的跨膜信号受体，通过与配体结合启动一系列分子级联在神经系统损害中参与神经炎症的调控。自噬是由溶酶体介导的一种降解途径，主要降解细胞器内受损及冗余成分的氨基酸，衰老的细胞器及胞内病原体。近年来，自噬还被认为是一种先天免疫的防御机制，而 TLR4可能担任了一个至今未被我们发现的自噬发生的环境传感器的作用。研究发现在巨噬细胞中，TLR4在识别配体-LPS后能够触发自噬反应，而在TBI后自噬的过度激活是否与TLR4的激活相关；在给予TLR4抑制剂后能否减轻 TBI后神经元自噬的程度以及 TLR4的下游信号分子MyD88、TRIF是否参与了神经元自噬的调控，本课题将分三部分进行阐述。
　　第一部分大鼠脑创伤后TLR4的表达变化及在继发性脑损伤中的作用
　　目的：应用电子控制性脑皮质撞击损伤（eCCI）方法复制SD雄性大鼠TBI模型，给予TLR4抑制剂TAK-242干预，检测海马区TLR4的表达变化及在继发性脑损伤中的作用。
　　方法：成年雄性SD大鼠96只数字随机分四组：①假手术组（Sham group）；②脑创伤组（TBI group）；③脑创伤+溶剂组（DMSO group）；④脑创伤+TAK-242组（TAK-242 group）。采用eCCI方法复制TBI模型，取伤后6 h、12 h、24 h、48 h4个时间进行检测：①HE染色观察脑组织病理形态学改变；②免疫组化检测海马区TLR4的表达、定位；③荧光定量PCR检测海马区TLR4 mRNA的表达；④Western-blot检测海马区TLR4蛋白的表达；⑤干湿比重法检测脑组织水含量；⑥另取20只SD大鼠于TBI后8、9、10天进行Morris水迷宫测试，检测其空间学习记忆能力。应用 Image Proplus6.0、Image J和Image Lab4.1软件分析系统进行定量分析测定，数据使用均数±标准差表示，用SPSS17.0统计软件进行统计分析。以P<0.05，表示差异有统计学意义。
　　结果：1 HE染色：Sham组大鼠脑组织结构正常，皮层和海马区神经元排列整齐，细胞数量多且形态正常；TBI组和 DMSO组创伤灶及周边组织明显水肿，皮层和海马区神经元胞体肿胀明显，核仁皱缩浓染明显，细胞间隙变大，血管扩张明显，出现神经元变性及坏死；TAK-242治疗组较TBI组和DMSO组相比，神经元胞体肿胀缓解，核浓缩明显减轻，神经元周围间隙明显较小；2 TLR4免疫组化结果：TLR4在海马区主要定位于神经元细胞的胞膜。Sham组偶可见阳性细胞，着色浅淡；与 Sham组比较，TBI组和DMSO组，TLR4阳性细胞显著增多，着色加深，免疫反应性增强（P<0.05）；TAK-242治疗组与TBI组和DMSO组相比， TLR4免疫反应性明显减弱（P<0.05）；3荧光定量PCR结果：与Sham组相比，TBI和DMSO组海马区TLR4 mRNA表达显著升高（P<0.05）， TAK-242处理后，TLR4 mRNA表达明显降低（P<0.05）；4 Westernblot结果：Sham组TLR4的蛋白有少量表达，在各时间点均无明显变化；TBI组和DMSO组TLR4的蛋白表达量在伤后6 h开始升高，于24 h达高峰，持续至伤后48 h，与Sham组比较均有统计学意义（P<0.05）；TAK-242组各时间点TLR4蛋白表达趋势与TBI和DMSO组相似，但是其蛋白表达量明显降低（P<0.05）；5脑组织水含量：Sham组各时间点脑组织水含量未见差异；DMSO组各时间点含水量与TBI组相似，无统计学意义（P>0.05），但均明显高于Sham组（P<0.05)；TAK-242组各时间点水含量较TBI组明显减少（P<0.05）；6 Morris水迷宫结果：于TBI后第8-10天对各组大鼠进行Morris水迷宫测试。TBI组和DMSO组伤后第8-10天搜索安全岛平均潜伏期较Sham组均明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）；TAK-242组伤后第8-10天搜索安全岛运动轨迹、潜伏期均较TBI和DMSO组明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　小结：应用eCCI方法成功建立了大鼠局灶性TBI模型；大鼠TBI后海马区TLR4表达上调，加重TBI后继发性脑损伤；给予TAK-242进行干预后，可以降低TLR4的激活，减轻脑组织含水量，改善TBI后大鼠学习和记忆功能，具有一定神经保护作用。
　　第二部分大鼠脑创伤后TLR4拮抗剂对海马区神经元自噬的影响
　　目的：探讨大鼠TBI后海马区神经元自噬的激活以及TLR4是否调控了海马区神经元自噬的表达。
　　方法：TBI模型同上，95只雄性 SD大鼠随机分四组。①假手术组（Sham group）；②脑创伤组（TBI group）；③脑创伤+3-MA组（3-MA group）；④脑创伤+TAK-242组（TAK-242 group）。取伤后6 h、12 h、24 h、48 h4个时间对下列指标进行检测：①透射电镜观察海马区神经细胞超微结构改变，检测自噬体；②免疫组化检测海马区 LC3、Beclin1的表达、定位；③Western-blot检测海马区自噬相关蛋白LC3、Beclin1蛋白的表达；④荧光双标检测海马区LC3和神经元标记NeuN的表达、定位。定量分析和统计方法同第一部分。
　　结果：1透射电镜结果：在TBI后24 h，神经元胞核周围有大量损伤后肿胀及变性的线粒体，并可见到双层膜样结构环绕受损线粒体后形成的自噬小体；2 LC3、Beclin1免疫组化结果：LC3主要定位于海马区神经元的胞质中，Sham组可见少量阳性细胞，着色浅淡；与Sham组比较， TBI组于伤后6 h可见阳性细胞显著增多，着色加深，免疫反应性增强，伤后24 h达高峰，48 h略有下降，但仍显著高于Sham组（P<0.05）；3-MA组和TAK-242组与TBI组比较，LC3阳性细胞数显著减少，着色变浅，免疫阳性反应性明显减弱（P<0.05）。Beclin1也主要定位于海马区神经元的胞质中，Sham组偶见阳性细胞，着色浅淡；与Sham组比较， TBI组于伤后6 h可见阳性细胞明显增多，着色加深，免疫反应性增强，至48仍维持在强表达水平（P<0.05）；与TBI组相比较，3-MA组和TAK-242组各时间点阳性表达与免疫反应明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；3 LC3的Westernblot结果：Sham组LC3II/LC3I的比值在各时间点无明显变化；与Sham组比较，TBI组LC3II/LC3I的比值随着伤后时间的推移，逐渐增高，高表达状态持续至伤后48 h（P<0.05）；3-MA组和TAK-242组LC3II/LC3I的比值较TBI组在伤后各时间点均明显降低，有统计学意义（P<0.05）；4 Beclin1的Westernblot结果：Sham组Beclin1的蛋白表达较低，在各时间点无明显变化；与Sham组比较，TBI组Beclin1的蛋白表达于伤后6 h出现显著增高，伤后24 h达高峰，48 h略有下降，但仍显著高于Sham组（P<0.05）；与TBI组相比较，3-MA组和TAK-242组Beclin1蛋白表达在各时间点均明显减少（P<0.05）；5海马区LC3与神经元标记NeuN荧光双标检测结果：TBI组24 h可见海马CA1区大量红色荧光（LC3）与绿色荧光（NeuN）重叠呈橘黄色聚集，表明该区神经元发生了自噬；3-MA组和TAK-242组24 h显示标记LC3的红色荧光明显较弱，与TBI组相比，Merged后的荧光重叠明显减少，表明神经元自噬水平的下降。
　　小结：大鼠TBI后于6-48 h可检测到海马区神经元自噬现象的发生，应用TAK-242能够和自噬抑制剂3-MA发挥同样的效果，即明显抑制了TBI后海马区神经元自噬的发生程度，因此TBI后TLR4可能通过某种途径介导了海马区神经元自噬的发生。
　　第三部分大鼠脑创伤后TLR4介导MyD88/TRIF通路在海马区神经元自噬调节的分子机制研究
　　目的：通过使用 MyD88路经抑制剂 MIP和 TRIF路经抑制剂Resveratrol进行干预处理，明确TBI后TLR4介导的MyD88或TRIF信号转导通路是否参与了调节海马区神经元自噬的发生。
　　方法：TBI模型同上，将85只SD大鼠随机分五组。①假手术组（Sham group）；②脑创伤组（TBI group）；③脑创伤+TAK-242组（TAK-242 group）；④脑创伤+ MIP组（MIP group）；⑤脑创伤+ Resveratrol组（RV group）。取伤后12 h、24 h、48 h3个时间对下列指标进行检测：①免疫组化检测海马区MyD88、TRIF的表达、定位；②Westernblot检测海马区 TLR4、MyD88、TRIF、Beclin1蛋白的表达；③荧光双标检测海马区TLR4、Beclin1分别和神经元标记NeuN的双标定位。定量分析和统计方法同第一部分。
　　结果：1 MyD88、TRIF免疫组化结果：MyD88主要定位于海马区神经元的胞浆，Sham组可见少量MyD88阳性细胞，呈淡黄色；与Sham组比较，TBI组于伤后12 h可见阳性细胞显著增多，呈棕黄色，持续阳性表达至48 h（P<0.05）；与TBI组比较，TAK-242组和MIP组中MyD88阳性细胞数显著减少，免疫阳性反应性明显减弱（P<0.05）；RV组中， MyD88免疫反应性与TBI组一致，两组间无统计学意义（P>0.05）。TRIF阳性表达也定位于海马区神经元的胞浆，Sham组偶可见阳性细胞，免疫阳性反应不随时间发生变化；与Sham组比较，TBI组中各时间点均可见大量TRIF阳性细胞，着色加深，免疫反应性显著增强（P<0.05）。TAK-242组和MIP组结果与TBI组一致，三组间无统计学意义（P>0.05）。RV组与Sham相似，与TBI组比较，TRIF阳性细胞显著减少，着色浅淡，免疫反应性显著减弱（P<0.05）；2 TLR4的Westernblot结果：Sham组TLR4的蛋白表达较低，在各时间点无明显变化；与 Sham组比较，TBI组TLR4蛋白显著增高，高表达状态持续至伤后48 h（P<0.05）；与TBI组相比较，TAK-242组TLR4蛋白表达在各时间点均显著降低（P<0.05）；在MIP组和RV组，TLR4蛋白表达与TBI组一致，各时间点均呈高表达状态；3 MyD88的Westernblot结果：Sham组MyD88蛋白表达量较低，在各时间点无明显变化；与Sham组比较，TBI组在各时间点MyD88蛋白表达均显著增高（P<0.05）；与TBI组相比较，TAK-242组和MIP组中MyD88蛋白表达在各时间点均显著降低（P<0.05）；RV组MyD88蛋白表达与TBI组一致；4 TRIF的Westernblot结果：Sham组TRIF蛋白表达量较低，在各时间点无明显变化；与Sham组比较，TBI组、TAK-242组和MIP组中在各时间均出现TRIF蛋白的高表达（P<0.05），三组间无统计学意义（P>0.05）。RV组TRIF蛋白表达与Sham组相似；5 Beclin1的Westernblot结果：Sham组Beclin1蛋白表达相对较低，在各时间点无明显变化；与Sham组比较，TBI组于伤后12 h出现Beclin1蛋白量表达增高，持续至48 h，在各时间点均显著增高（P<0.05）；与TBI组相比较，TAK-242组和MIP组Beclin1蛋白表达在各时间点均明显减少（P<0.05），两组间无统计学意义（P>0.05）；RV组Beclin1蛋白表达与TBI组一致；6海马区 TLR4与神经元标记 NeuN荧光双标检测结果：TLR4为DyLight594标记的细胞胞膜红色荧光，NeuN为DyLight488标记的细胞胞浆绿色荧光，TBI组24 h可见海马CA1区大量红色荧光与绿色荧光重叠呈橘黄色聚集；TAK-242组Merged后的荧光重叠明显减少；7海马区Beclin1与神经元标记NeuN荧光双标检测结果：Beclin1为DyLight594标记的细胞胞浆红色荧光，NeuN为DyLight488标记的细胞胞核周绿色荧光；TBI后24 h可见海马CA1区Beclin1红色荧光明显增强，Merged后重叠呈橘黄色聚集；TAK-242组和MIP组，Beclin1红色荧光强度明显降低，Merged后重叠明显减少；RV组与TBI相似，Merged后可见橘黄色重叠聚集（Fig.9-4），表明TAK-242和MIP均可抑制自噬发生的程度。
　　小结：大鼠TBI后TLR4介导的MyD88和TRIF信号转导通路均被激活，共同参与了继发性脑损害发生；而 TAK-242通过TLR4/MyD88/Beclin1信号通路降低了TBI后海马区神经元的自噬。
　　结论：大鼠颅脑创伤后，TLR4的激活加重了继发性脑损伤，TAK-242通过抑制TLR4/MyD88/Beclin1信号转导通路减轻了海马区神经元自噬，减轻脑水肿，改善空间学习和记忆能力，具有神经保护作用。

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引言

第一部分大鼠脑创伤后TLR4的表达变化及在继发性脑损伤中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分大鼠脑创伤后TLR4拮抗剂对海马区神经元自噬的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分大鼠脑创伤后TLR4介导MyD88或TRIF通路在海马区神经元自噬调节的分子机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

本课题创新点

参考文献

结论

综述一:自噬及在神经系统损伤中的作用

综述二:TLR4与脑损伤的研究进展

致谢

个人简历