绵羊肺炎支原体(Y-98标准株)P30基因真核表达载体构建与P30-IFNγ融合蛋白疫苗研制

摘要

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)是绵羊养殖过程中的常见病原菌,可以引发绵羊支原体肿炎。该病流行范围广,发病期长,给养羊业造成了巨大的经济损失。
　　本文选择P30外膜蛋白为抗原蛋白,同时以细胞因子IFNγ为疫苗佐剂,将两者串联融合表达。以绵羊肺炎支原体(MO)标准株Y98基因组为模板,设计一对特异性引物,PCR扩增得到795bp的P30目的基因,与文献报道的P30基因序列一致;提取小鼠总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增IFNγ目的基因。将两者定向克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,得到pET-P30、pET-IFNγ和pET-P30-IFNγ重组质粒,转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)。重组菌株分别命名为BL21(DE3)(pET-P30)、BL21(DE3)(pET-IFNγ)和BL21(DE3)(pET-P30-IFNγ)。由IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot分析,得到30.0KD、20.1KD和47.2KD的特异条带,与预期的P30外膜蛋白、IFNγ以及P30-IFNγ融合蛋白大小一致,且均具有良好的反应原性。
　　对3种重组菌株进行诱导表达,纯化得到可溶性目的蛋白,制备P30基因工程疫苗、IFNγ佐剂疫苗以及P30-IFNγ融合蛋白疫苗。小鼠免疫保护实验结果显示,P30基因工程疫苗的免疫保护率为60％,IFNγ佐剂疫苗的免疫保护率为20％,P30-IFNγ融合蛋白疫苗的免疫保护率达到80％。间接ELISA实验证实,经100μL与200μL剂量P30-IFNγ融合蛋白疫苗免疫的小鼠血清中,P30抗体效价分别为1:32000与1:64000。经IFNγ佐剂疫苗免疫的小鼠血清中,未检测出阳性P30抗体效价。以上结果证实,所制备的疫苗安全有效,且融合蛋白疫苗中的细胞因子IFNγ组分可以调节机体免疫机能,增强疫苗的免疫保护效果。
　　结合近年来疫苗研制领域的发展动念,本研究还对转基因植物疫苗的研制进行了探究。设计特异性引物,扩增了P30目的基因,将其定向克隆到含黄色荧光蛋白(yellowfluorescent protein,YFP)标签的真核表达载体pCAMBIA1300-YFP中,构建了重组表达质粒pCAMBIA1300-P30-YFP并转化农杆菌(Agrobacterium)感受念细胞,侵染烟草(tobacco)叶片。通过激光共聚焦成像显微镜(cofocal imaging microscope)观察到融合表达的黄色荧光蛋白P30-YFP,Western blot实验得到57KD的特异条带,RT-PCR检测到P30基因在烟草叶片中转录。以上结果证实P30基因在烟草叶片中成功进行了瞬时表达。