谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达系统的构建

摘要

谷氨酸棒状杆菌是一种革兰氏阳性细菌，属放线菌目棒状杆菌属，已被广泛用于氨基酸的工业化生产。目前，谷氨酸棒状杆菌被人们普遍认为是蛋白分泌生产的优良宿主菌。但是，由于谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体的缺乏，限制了其在蛋白分泌生产中的应用。本论文利用DNA重组技术，构建了谷氨酸棒杆菌组成型表达和诱导型表达两类新分泌表达载体。新分泌表达载体分别使用了Tat和Sec途径信号肽来介导异源蛋白的胞外分泌。利用两个报告基因对组成型表达载体在谷氨酸棒状杆菌中的可用性进行了验证。本论文主要研究成果如下:
　　(1)构建了E.coli-C.glutamicum基础穿梭载体pAU2。载体pAU2携带E.coli的质粒复制子rep(pMB1)、C.glutamicum的质粒复制子rep(pBL1)以及卡那霉素抗性基因aphⅠ，卡那霉素抗性基因aphⅠ是E.coli和C.glutamicum转化子的筛选标记。质粒pAU2能转化C.glutamicum，是E.coli-C.glutamicum穿梭质粒。
　　(2)构建了C.glutamicum组成型分泌表达系统，包括两个分泌型表达载体pAU3和pAU5及一个非分泌型表达载体pAU4。以pAU2为基础，添加人工合成的克隆/表达盒A、B和C，构建成表达载体pAU3、pAU4和pAU5。三个克隆/表达盒A、B和C都使用强启动子tac-M以及C.glutamicum的核糖体结合位点(RBS)一致序列来控制目基因的组成型表达;其不同之处在于:pAU3的A盒使用Tat分泌型cgR_0949信号序列来介导蛋白质的胞外分泌，pAU5的B盒使用Sec分泌型cgR_2070信号序列来介导蛋白质的胞外分泌，而对照载体pAU4的C盒不含有信号序列。
　　(3)以pAU2为基础，构建了携带LacⅠ阻遏蛋白编码基因lacⅠPF104以及T7RNA聚合酶编码基因T7geneⅠ的载体pAU11。
　　(4)构建了C.glutamicum诱导型分泌表达系统，包括两个分泌型表达载体pAU12和pAU14及一个非分泌型表达载体pAU13。以pAU11为基础，添加人工合成克隆/表达盒D、E和F，构建成表达载体pAU12、pAU13和pAU14。三个克隆/表达盒D、E和F都使用强启动子T7-lacO以及C.glutamicum的核糖体结合位点(RBS)一致序列来控制目基因的诱导型表达。T7geneⅠ编码的T7RNA聚合酶和lacⅠPF104基因编码的LacⅠ阻遏蛋白参与了目的基因的诱导表达。克隆/表达盒D、E和F的不同之处在于:pAU12的D盒使用Tat分泌型cgR_0949信号序列来介导蛋白质的胞外分泌，pAU14的F盒使用Sec分泌型cgR_2070信号序列来介导蛋白质的胞外分泌，而对照载体pAU13的E盒不含有信号序列。
　　(5)验证了Tat分泌型表达载体pAU3的可用性。以氯霉素酰基转酶(CAT)基因作为报告基因，构建重组分泌型表达载体pAU3-cat和pAU4-cat，同时电转化谷氨酸棒杆菌，获得工程菌株ATCC14067/pAU3-cat和ATCC14067/pAU4-cat。SDS-PAGE试验结果显示:14067/pAU3-cat的培养液上清样品中，出现特异性蛋白条带;而其细胞裂解液上清样品泳道中无特异性蛋白条带的出现。CAT蛋白活性分析显示:14067/pAU4-cat和14067/pA U3-cat细胞裂解液上清CAT比活力分别为8.11±0.53U/mg蛋白质和1.06±0.09U/mg蛋白质，而14067/pAU3-cat培养液上清CAT比活力为190.31±13.99U/mg蛋白质，进一步证明在14067/pAU3-cat中，CAT蛋白被高效分泌表达，大部分的胞内CAT蛋白被分泌在培养基里。SDS-PAGE和CAT活性分析充分说明了C.glutamicum/pAU3是一个Tat分泌型基因高效表达系统。
　　(6)验证了Sec分泌型表达载体pAU5的可用性。以枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶AmyE作为报告基因，构建重组分泌型表达载体pAU5-amyE，同时电转化谷氨酸棒杆菌，获得工程菌株ATCC14067/pAU5-amyE。SDS-PAGE试验结果显示:14067/pAU5-amyE的培养液上清样品泳道中，呈现一条清晰的特异性蛋白条带;Westen Blotting结果显示:14067/pAU5-amyE而细胞裂解液上清中无特异性蛋白条带，从而证明表达的AmyE多肽，没有积累在细胞质中，而是被完全分泌到培养液中。α-淀粉酶AmyE蛋白活性分析显示:14067/pAU5-amyE的培养液上清液中的α-淀粉酶活力为103.24±7.14U/mg蛋白质，而14067/pAU5-amyE的细胞裂解液上清液中并没有发现α-淀粉酶活力。这些实验结果说明C.glutamicum/pAU5是一个Sec分泌型基因高效表达系统。

目录

声明

摘要

1．1．1 谷氨酸棒杆菌的简介

1．1．2 谷氨酸棒杆菌的应用

1．2 重组蛋白工业化生产之宿主菌的研究概况

1．2．1 大肠杆菌表达系统

1．2．2 枯草芽孢杆菌表达系统

1．2．3 乳酸乳球菌表达系统

1．2．4 谷氨酸棒杆菌表达系统

1．3 重组蛋白分泌表达之信号肽的研究进展

1．4 谷氨酸棒杆菌的分子生物学研究

1．4．1 表达载体

1．4．2 谷氨酸棒杆菌分泌表达系统

1．5 立题依据和意义

1．6 本研究的主要研究内容

2．1．1 菌株、质粒及引物

2．1．2 抗生素

2．1．3 主要培养基及试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．2 操作方法

2．2．1 基因组DNA的提取

2．2．2 质粒的提取

2．2．3 PCR反应体系及条件

2．2．4 质粒和PCR产物的酶切、连接

2．2．5 感受态细胞的制备和连接产物的转化

2．2．6 序列测定

2．2．7 蛋白质浓度测定

2．3 菌种保藏

2．4．1 pAU1的构建

2．4．2 基础穿梭型载体pAU2的构建

2．5 C．glutamicum新分泌型基因高效组成型表达系统的构建

2．5．1 分泌型表达载体pAU3的构建

2．5．2 非分泌型表达载体pAU4的构建

2．5．3 高效分泌表达载体pAU5的构建

2．6 C．glutamicum新分泌型基因高效诱导型表达系统的构建

2．6．2 载体pAU11的构建

2．6．4 非分泌型载体pAU13的构建

2．6．5 分泌型表达载体pAU14的构建

2．7 CAT蛋白的分泌表达

2．7．1 重组载体pAU3-cat的构建

2．7．2 重组载体pAU4-cat的构建

2．7．3 C．glutamicum样品的制备和培养

2．7．4 氯霉素酰基转移酶(CAT)的表达分析

2．8．2 C．glutamicum样品的制备和培养

2．8．3 α-淀粉酶AmyE在谷氨酸棒状杆菌中分泌表达的SDS-PAGE分析

2．8．5 α-淀粉酶AmyE活性测定

3 结果与分析

3．1．1 E．coli-C．glutamicum基础穿梭载体pAU2的构建

3．1．2 表达载体pAU3、pAU4和pAU5的构建

3．1．3 Tat分泌型表达载体pAU3的可用性验证

3．1．4 Sec分泌型表达载体pAU5的可用性验证

3．2 C．glutamicum新分泌型基因高效诱导型表达系统的构建

3．2．1 载体pAU10和pAU11的构建

3．2．2 载体pAU12、pAU13和pAU14的构建

4 讨论

5 结论

参考文献

硕士期间发表文章

作者简历

致谢