HBV/HCV阴性的原发性肝细胞癌全基因组DNA甲基化分析及部分功能基因的表达水平验证

摘要

目的：肝细胞癌在中国的发病率和死亡率都排在各类肿瘤疾病的前列，由于发病隐匿、进展迅速，大多数病人就诊时已经是中晚期。DNA甲基化作为主要的表观调控机制，近年来在受到了大量关注。本研究通过检测原发性肝细胞癌病人的癌组织及其配对的癌旁组织的全基因组甲基化水平差异、基因表达差异及蛋白表达差异来探索原发性肝细胞癌的特征性甲基化谱和原发性肝细胞癌的关系。
　　方法：1.芯片数据的获取:(1)收集来自广西医科大学附属肿瘤医院标本库、第一附属医院手术切除经病理证实为肝细胞癌组织及与其对应的癌旁组织共18对（36例）标本，均得到患者知情同意。将基因组DNA分离后进行重亚硫酸盐转化，然后采用illumina HumanMethylation27芯片平台得到全基因组DNA甲基化数据，并结合TCGA数据库中符合我们研究标准的HBV、HCV病毒感染阴性的甲基化芯片数据，采用R语言的RnBeads包进行背景校正;质控后统计得到差异甲基化位点。(2)经过功能富集、通路富集分析后选取感兴趣的差异甲基化位点进行下一步分析。2、实验验证:(1)对我们感兴趣的位点所在的基因设计甲基化特异性引物，用PyroMark Assay Design2.0甲基化引物设计软件设计特异位点所在基因的上、下游引物和甲基化测序引物，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)验证扩增产物的特异性。使用QIAGEN的PyroMark Q96焦磷酸测序(Pyrosequencing)平台检测所选基因在肝细胞癌组织及其相应的癌旁组织中的DNA甲基化水平。(2)收集新的样本，采用实时荧光定量PCR(Realtimefluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)以及免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）染色检测所选基因在肝细胞癌组织、与其对应的癌旁组织中的表达情况。所有的统计工作由R软件包完成，设定α=0.05。
　　结果：1、临床特征:纳入芯片研究的样本平均患者平均年龄54.9±11.5岁，其中男性17例，女性1例。有吸烟史的12人，饮酒者6人。2、甲基化芯片检测结果:使用limma包提供的经验贝叶斯法用等级线性模型计算P值，进一步以甲基化状态发生跨级跃迁同时满足|Delta Beta|＞0.2作为筛选标准，鉴定出了444个基因做进一步的生物信息学分析，其中包含了271个低甲基化位点、223个高甲基化位点。3、功能注释:高甲基化位点所在的基因功能多集中在发育、细胞过程和细胞运动能力等方面;而低甲基化位点所在基因的功能多集中在角质化和应激方面。对这些位点进行聚类分析发现样本能够很好地被区分开来。4、基于功能分析及文献检索，我们首次选择了2个甲基化水平显著降低的个基因(LRSAM1、VAV1)的甲基化位点做了焦磷酸测序验证，发现两者均在肝细胞癌组织中呈现低甲基化现象，与芯片结果完全一致，并且与芯片甲基化程度Beta值呈线性相关。5、用RT-qPCR检测以上基因的mRNA水平，结果显示LRSAM1（0.43±0.93，p=0.011）以及VAV1（0.84±1.82，p=0.011）的mRNA水平则在癌组织中显著上调。6、用免疫组化技术验证以上基因编码蛋白在组织切片中的表达情况。与mRNA验证结果一致，LRSAM1、VAV1在癌与癌旁表达阳性率分别为82％(37/45)-42％(13/31)，57％(26/46)-41％(15/37)。
　　结论：1、初步建立了原发性肝细胞癌的特征甲基化谱，为后续功能和机制的研究奠定了一定的基础。2、我们首次发现并验证了LRSAM1、VAV1在原发性肝细胞癌中甲基化程度明显降低的基因，并采用RT-qPCR和免疫组织化学染色实验验证了它们在mRNA和蛋白水平上的高表达。

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英文缩略词

摘要

第一章 基于全基因组DNA甲基化芯片技术建立HBV／HCV阴性的原发性肝癌及癌旁组织DNA甲基化谱

1 前言

2 材料及方法

2．1 组织标本

2．2 主要试剂、耗材及设备

2．3 实验方法

2．4 TCGA数据库数据挖掘

2．5 甲基化芯片数据分析

2．6 生物信息学分析

2．7 统计学分析

3 结果

3．1 样本信息汇总

3．2 探针级别和样本级别的质控

3．3 SVA分析结果

3．4 肝癌组织与癌旁组织的DNA甲基化差异

3．5 GO分析

3．6 Pathway分析

4 讨论

参考文献

第二章 部分功能基因的甲基化程度验证及表达水平验证

1 前言

2 材料及方法

2．1 组织标本

2．2 主要试剂、耗材及设备

2．3 实验方法

2．4 统计学分析

3 结果

3．1 样本信息汇总

3．2 甲基化位点的甲基化程度验证

3．3 实时荧光定量PCR结果

3．4 免疫组织化学染色结果

4 讨论

参考文献

第三章 综述 DNA甲基化与肿瘤

全文小结

攻读学位期间发表的学术论文及专利申请

致谢