胰岛素对糖尿病小鼠创面感染铜绿假单胞菌生物膜形成及环二鸟苷酸调控影响的体内外研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 胰岛素对细胞内环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌实验菌株影响的体外研究 第一节 胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞实验菌株生长的影响 目的：观察胰岛素是促进或是抑制c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株的生长。 方法：先进行实验菌株复苏，然后增菌、调菌液浓度OD600值并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度，进行实验分组，按胰岛素浓度进行分组，胰岛素组最终浓度分别为200nU/ml、200μU/ml、200mU/ml，热变性胰岛素组为对照组;将调整好的菌液混匀、移入24孔板，封口膜封口，37℃，180转/分钟，持续培养，每个观察时间点进行活菌计数。 结果：200mU/ml、200μU/ml、200nU/ml的胰岛素浓度比热变性后胰岛素（对照组）干预c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH、对照株PAO1以及c-di-GMP高表达株PAO1△wspF，在第4、8、12、24小时时生长的菌落是没有显著差异的。 结论：不同浓度的胰岛素及其变性后的胰岛素对c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株生长影响不明显。 第二节 胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌实验菌株生物膜形成的影响 目的：观察胰岛素对c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株BF形成的影响。 方法：先进行实验菌株复苏，然后增菌、调菌液浓度OD600值并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度，进行实验分组，按胰岛素浓度进行分组，胰岛素组最终浓度分别为200nU/ml、200μU/ml、200mU/ml，热变性胰岛素组为对照组;采用96孔板微量滴定BF分析法进行分析，37℃恒温箱，110转/分钟，持续培养12小时，之后按结晶紫BF半定量检测法进行实验。 结果：(1)胰岛素促进c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株的BF形成;BF形成增加幅度最大的是c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH，增加15.96％～24.04％;其次为对照株PAO1，增加11.42％到15.71％;c-di-GMP高表达株PAO1△wspF的BF增加最少，增加5％～10％。(2)低表达株PAO1/Plac-yhjH，在200mU/ml、200nU/ml的胰岛素浓度比变性胰岛素组所形成的的BF明显增多(P＜0.01)。对照株PAO1在200mU/ml、200μU/ml的胰岛素浓度比变性胰岛素组所形成的BF明显增多(P＜0.05)。而高表达株PAOl△wspF，不同胰岛素浓度组比变性胰岛素组所形成的BF有所增多，但差异无统计学意义。 结论：胰岛素能够促进c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH和对照株PAO1的BF形成;胰岛素对c-di-GMP高表达株PAO1△wspFBF形成的影响不明显。 第三节 胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌实验菌株中c-di-GMP表达的影响 目的：观察胰岛素对不同P.a实验菌株中c-di-GMP表达的影响。 方法：先进行实验菌株（PAO1/PcdrA-gfp、PAO1/Plac-yhjH/PcdrA-gfp、PAOl⊿wspF/PcdrA-gfp）复苏，然后增菌、调菌液浓度OD600值并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度，进行实验分组：按胰岛素浓度进行分组，胰岛素组最终浓度分别为200nU/ml、200μU/ml、200mU/ml，热变性胰岛素组为对照组;96孔板微量滴定分析法进行，37℃，185rpm，持续培养12小时，测定OD600和gfp的荧光值，将测得的gfp数值除以所测得的OD600，就得到RFU。 结果：(1)胰岛促进对照株PAO1/PcdrA-gfp、低表达株PAO1/Plac-yhjH/PcdrA-gfp细胞内c-di-GMP的表达;其中，与变性胰岛素组比较，促进c-di-GMP表达增加最多的是低表达株PAO1/Plac-yhjH，增加36.27％-47.75％;其次是对照株PAO1，增加2.99％-43.13％;但是胰岛素对高表达株PAO1△wspF/PcdrA-gfpc-di-GMP表达的影响不明显。(2)与变性胰岛素组相比较，低表达株PAO1/Plac-yhjH在200mU/ml、200μU/ml，200nU/ml的胰岛素浓度组明显促进c-di-GMP的表达(P＜0.05);PAO1在200mU/ml胰岛素浓度组也明显促进c-di-GMP的表达(P＜0.01),对c-di-GMP高表达株PAO1⊿wspF的c-di-GMP表达影响不明显。 结论：胰岛素能够促进对照株PAO1和c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH细胞内c-di-GMP的表达;对c-di-GMP高表达株PAO1△wspF的c-di-GMP表达影响不明显。 第二部分 胰岛素对糖尿病小鼠创面感染铜绿假单胞菌生物膜形成及环二鸟苷酸调控影响的体内研究 第一节 细胞内环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌创面感染小鼠模型的建立 目的：建立c-di-GMP表达不同的P.a创面感染的小鼠模型，为下一步的研究做好准备。 方法：1.实验小鼠准备：雄性、8周龄的db/db糖尿病小鼠，血糖超过20mmol/L为实验组，血糖小于11.1mmol/Ldb/db非糖尿病小鼠作为对照组;在广西医科大学动物房SPF级别进行适应环境饲养1周后开始进行实验;2.体外细菌悬浮液的准备：先进行实验菌株复苏，然后增菌、调菌液浓度OD600值并10倍系列稀释到所需要的浓度;3.手术当天先对小鼠进行麻醉、备皮、消毒、无菌眼科剪刀将去除小鼠背部约1.5x1.5cm大小的全层皮肤，无菌半透明敷贴覆盖，100μl实验菌株于外科膜下创面的上面之间注射，建立慢性P.a创面感染的小鼠模型。 结果：术后第3天左右可见外科膜下有脓液形成即成功建立c-di-GMP表达不同的P.a创面感染的小鼠模型，为下一步的研究做好准备。 结论：采用db/db小鼠，成功建立c-di-GMP表达不同的P.a创面感染小鼠模型。 第二节 胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌创面感染小鼠模型观察指标影响的检测 目的：对比观察胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面愈合、体重改变、菌量负荷及其对阿米卡星耐药的影响，观察胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面P.aBF形成、炎症细胞的浸润以及炎症介质释放表达的影响。 方法：先前已经建立糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a创面感染的动物模型，观察实验前及每个观察时间点测量胰岛素后糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面情况、创面愈合和体重变化的影响，采用平板计数法，检测胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面菌量负荷情况及其对阿米卡星耐药的影响，采用HE染色来观测胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面炎症细胞浸润情况;采用PNA-FISH和ConA-FITC染色来判断、证实糖尿病慢性c-di-GMP表达不同的感染创面P.a及其BF的存在;采用RT-qPCR检测方法检测胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面炎症介质的影响。 结果：(1)在c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH组中，非糖尿病组P.a感染创面愈合得最快，糖尿病+胰岛素组比糖尿病组愈合得慢;而在对照株PAO1组的术后第16天，糖尿病+胰岛素组比糖尿病组愈合得慢;P.a感染创面愈合得最慢是c-di-GMP高表达株PAO1△wspF组。(2)在c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH组术后第4天、第16天中，糖尿病+胰岛素组创面感染的P.a对阿米卡星的耐药率比糖尿病组显著增高。(3)在c-di-GMP低表达株PAO1/PlacyhjH组中，糖尿病+胰岛素组的P.a创面感染中，能看到更多PMNs的侵润、更多BF形成和更多炎症介质释放。但是胰岛素对c-di-GMP高表达株PAO1△wpF组创面愈合、BF形成方面影响不明显。 结论：(1)在非糖尿病组中，c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH小鼠创面愈合得快，而c-di-GMP高表达株PAO1△wspF的小鼠创面愈合得慢，说明P.a感染创面愈合与P.ac-di-GMP信号通路有关;(2)在对照株PAO1和c-di-GMP低表达株PAO1/Plac-yhjH的糖尿病组中，胰岛素可能通过促进BF形成、PMNs浸润及炎症介质的释放，从而影响糖尿病小鼠P.a创面愈合;说明胰岛素对P.a创面感染的影响也可能是与细胞内c-di-GMP信号通路有关。