碱性成纤维细胞生长因子促进水牛类胚胎生殖干细胞形成的初步研究

摘要

本研究主要检测了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在水牛类胚胎生殖干细胞(EG-like)形成过程中的作用,并进一步利用与bFGF信号转导相关的信号阻断剂来研究PGCs重编程为EG-like细胞的分子机制,以期为水牛EG细胞系的建立提供有意义的指导。
　　 (1)对水牛类胚胎生殖干细胞饲养层体系的建立进行了研究。结果发现:组织块法培养获得的细胞状态优于酶消化法,组织块法更适合水牛胎儿成纤维细胞的分离培养;并且细胞传至三代,状态良好且核型正常率为80％,可用于饲养层的制备;经MTT法和Brdu免疫荧光检测,确定10μg/ml的丝裂霉素C处理水牛胎儿成纤维细胞3.5h既能有效抑制成纤维细胞增殖又能保持细胞良好的状态;并且能维持水牛胚胎生殖干细胞至8代。
　　 (2)对水牛原始生殖细胞(PGCs)体外培养特征进行了研究。结果表明:分离的PGCs呈圆形或椭圆形,比一般体细胞大,AP染色阳性;体外培养部分PGCs具有能动特性;培养4-5d,部分PGCs形成形态差异的克隆,部分以2个或3个PGCs聚集体形式存在。表明体外培养的PGCs具有异质性。
　　 (3)对水牛EG-like细胞的多能性进行了研究。结果表明水牛EG-like细胞表达AP、SSEA-1等细胞表面抗原;免疫荧光结果表明克隆表达Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc等多能性因子;PCR检测再次证明克隆表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性因子;体外分化实验表明克隆经悬浮培养能形成拟胚体,进一步单层分化可形成成纤维样、上皮样、平滑肌样等细胞类型。体外培养具有一定的自我更新能力,能扩增到8代。
　　 (4)对bFGF在水牛PGCs重编程为EG-like细胞过程中的作用进行了研究。结果发现bFGF在EG-like细胞形成过程中发挥至关重要的作用,随着bFGF添加浓度的升高(0,10,20,40ng/ml),EG-like细胞克隆形成数增多,克隆直径增大,当浓度为20ng/ml时效果最好。
　　 (5)对bFGF促进EG-like细胞形成的机制进行了研究。结果表明:水牛PGCs重编程为EG-like细胞过程中,P13K/AKT信号路径发挥主要作用,MAPK路径起着促进增殖的协同作用;P53失活促进水牛PGCs重编程为EG-like细胞。推测在水牛PGCs重编程为EG-like细胞的过程中,关键的信号调控事件是:bFGF激活P13K/AKT信号通路,进一步调控P53失活起主要作用;同时激活MAPK信号路径,起着促进增殖的协同作用。