甘蔗叶产黄酮内生真菌的筛选与鉴定

摘要

采用组织分离法从甘蔗叶中共分离出172株内生真菌，根据菌落形态特征初步筛选到10株不同的真菌（GZ-0、GZ-1、GZ-2、GZ-4、GZ-5、GZ-7、GZ-8、GZ-10、GZ-11和GZ-15），通过分子生物学方法鉴定，这10株真菌属于8属10种，分别为:玉蜀黍赤霉菌（Gibberellazeae）、塔地囊孢壳菌（Glomerella tucumanensis）、意大利果皮叶点霉（Phyllosticta capitalensis）、黑曲霉(Aspergillus niger)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、喙突脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、小球腔菌属（Leptosphaeria sp.）、博宁炭疽菌（Colletotrichum boninense）和炭角菌属（Xylaria sp.）。采用黄酮类化合物的显色反应、薄层层析法和紫外吸收光谱法对以上10株内生真菌的代谢产物进行黄酮类化合物的检测，共筛选到2株能够产黄酮类化合物的内生真菌GZ-4和GZ-5，其菌丝体总黄酮含量分别为1.21 mg/g和4.03 mg/g。
　　以菌株GZ-5菌丝体为研究材料，采用超声波辅助提取法，通过单因素实验和正交实验优化总黄酮的提取条件，结果表明，总黄酮的最佳提取条件为:超声功率47.5 W、超声时间25 min、提取温度70℃、乙醇浓度60％、料液比1∶60(g/mL)，在此优化条件下总黄酮的提取量为4.92 mg/g。菌株GZ-5总黄酮具有较好的体外抗氧化活性，对羟基自由基、亚硝酸盐、DPPH和超氧阴离子自由基有较强的清除作用。
　　采用牛津杯抑菌法检测菌株GZ-5总黄酮的抑菌效应的结果表明:该总黄酮对巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌这五种革兰氏阳性菌均具有良好的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制性最强，最低抑菌浓度为0.012 mg/mL。
　　通过单因素实验和正交实验优化菌株GZ-5产黄酮的培养条件的结果表明:最佳培养条件为接种量3％、时间7d、温度28℃、摇床转速175 r/min、装液量80 mL（150 mL三角瓶），在此培养条件下，每克菌丝体总黄酮含量可达7.65 mg，每100 mL培养液总黄酮产量可达8.57 mg。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物内生真菌的研究进展

1．1．1 植物内生真菌的定义

1．1．2 植物内生真菌的多样性

1．1．3 植物内生真菌的研究技术

1．1．4 植物内生真菌的生物学作用

1．1．5 植物内生真菌研究中存在的问题

1．1．6 植物内生真菌级代谢产物的多样性与作用

1．2 黄酮类化合物的概述

1．2．1 黄酮类化合物的生物合成机制

1．2．2 黄酮类化合物的主要药用功能

1．2．3 黄酮类化合物提取方法的研究进展

1．3 甘蔗叶与其内生真菌的研究现状

1．4 本研究的主要内容、目的及意义

2．1 实验材料

2．1．1 植物样品来源

2．1．2 主要试剂和培养基

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 内生真菌的分离与纯化

2．2．2 内生真菌的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 甘蔗叶内生真菌的分离与鉴定

2．3．2 甘蔗叶内生真菌的分布

2．4 小结与讨论

3．1 实验材料

3．1．1 实验菌株

3．1．2 主要试剂与培养基

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 菌株培养与检测样品的制备

3．2．4 样品Ⅱ的紫外吸收检测

3．2．5 产黄酮菌株菌丝体总黄酮含量的测定

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株的初筛与显色反应

3．3．2 薄层层析分析

3．3．3 紫外吸收光谱检测分析

3．3．4 总黄酮含量的测定

3．4 小结与讨论

第四章 菌株GZ-5总黄酮的提取及抗氧化活性测定

4．1 实验材料

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 菌株培养与总黄酮提取

4．2．2 菌丝体总黄酮含量测定

4．2．3 总黄酮提取的单因素实验

4．2．4 总黄酮提取的正交实验

4．2．5 总黄酮的抗氧化活性测定

4．3 结果与分析

4．3．1 单因素实验

4．3．2 正交实验

4．3．3 验证性实验

4．3．4 总黄酮抗氧化活性测定效果

4．4 小结与讨论

第五章 菌株GZ-5总黄酮的抑菌性测定

5．1 实验材料

5．1．1 实验菌株

5．1．2 主要试剂与培养基

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 供试菌株的活化

5．2．2 各菌株菌悬液的制备

5．3．1 总黄酮的抑菌活性效果

5．3．2 总黄酮的最低抑菌浓度(MIC)测定结果

5．4 小结与讨论

第六章 菌株GZ-5产黄酮培养条件的优化

6．1 实验材料

6．1．1 实验菌株

6．1．2 主要试剂与培养基

6．1．3 主要仪器

6．2 实验方法

6．2．1 菌株种子液的配制

6．2．2 菌丝体生物量的测定

6．2．3 菌丝体总黄酮产量测定

6．2．4 不同培养条件对总黄酮产量的影响

6．2．5 培养条件的正交实验设计

6．3 结果与分析

6．3．1 接种量对总黄酮产量的影响

6．3．2 培养时间对总黄酮产量的影响

6．3．3 培养温度对总黄酮产量的影响

6．3．4 摇床转速对总黄酮产量的影响

6．3．5 装液量对总黄酮产量的影响

6．3．6 正交实验

6．4 小结与讨论

7．1 总结

7．2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文