芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）R21的生物学特性和广谱抗真菌蛋白研究

摘要

由真菌病害引起的作物产量损失主要是土传病害和维管束病害。生物防治在真菌病害的防治中表现出良好的应用前景，但生防因子的特异性太强，严重制约了生物防治技术的推广应用。因此，开发广谱的生防因子是生物防治成功走向应用的重要因素。 本论文针对珠海市农业科学研究中心农业微生物学实验室分离自石斛兰叶片的广谱抗真菌芽胞杆菌(Bacillus sp．)R21展开研究。研究了芽胞杆菌R21的生物学特性、抗菌谱及其对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)的作用方式；并从R21发酵液中分离纯化了一种广谱抗真菌蛋白，研究了这种抗菌蛋白的生物学特性，并测定了该蛋白的分子量和氮(N)端15个氨基酸(Amino acid，Aa)序列；另外还以基因组DNA为模板，对编码该蛋白的结构基因进行了克隆。本文的研究工作，为将来利用基因工程开发抗性作物品种和开发广谱的生防产品提供技术支持。具体研究内容和结果如下： 1、R21的生物学特性研究。研究了R21对唯一碳源(果糖、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、精氨酸、苹果酸)和氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、酪蛋白、硝酸钾、氯化铵)的利用情况，培养基pH(pH 3.0、4.1、5.1、6.2、7.1、8.2、9.1、10.5)、培养温度(16℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、50℃)的变化对R21生长的影响。结果显示，R21的最佳碳源、氮源分别是蔗糖和牛肉膏；最适生长温度是37℃，在50℃也能较好生长；最适pH范围为6.2～8.0。 2、R21的广谱抗真菌特性研究。通过平板拮抗实验，发现R21对接受测试的不同植物病原真菌都有拮抗效果，抗菌谱极其广泛。它对尖孢镰刀菌西芹专化型(引起西芹黄萎病)、香蕉专化型4号小种(引起香蕉黄叶病)显示出很好的平板拮抗效果，还对分离自3种热带洋兰的9种病原真菌(石斛兰3种，编号为SHL-12、SHL-3、SHL-8；大花惠兰5种，编号为DHL-5、Baj、DHL-15E、DHL-33A、DHL-33B；万带兰1种，编号为SL-1)和分离自10种棕榈科植物的18种病原真菌都表现出良好的平板拮抗效果。R21对两种不同的尖孢镰刀菌(西芹专化型和香蕉专化型)的作用方式有所不同，镜检发现，R21引起西芹专化型菌丝体缢缩，产生的分生孢子膨大变形；而香蕉专化型菌丝体则表现为膨大扭曲，内容物成团，分生孢子膨大变形。 3、抗真菌蛋白的分离纯化。使用(10﹪、20﹪、30﹪、40﹪、50﹪、60﹪、70﹪、80﹪、90﹪)硫酸铵分级沉淀法分离抗菌蛋白，并利用分离得到的不同组分的蛋白对B10b、SHL-12、SHL-3、Bai、DHL-15E、DHL-33A、DHL-33B、芒果蒂腐病(Diplodianatalensis Pole(Evens))、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、西瓜枯萎病(Fusariumoxysporum f. sp-niveum)进行拮抗效果测定，结果显示只有20﹪硫酸铵盐析的蛋白组分对所有接受测定的真菌都具有抗性。 4、抗真菌蛋白的稳定性研究。通过对纯化的广谱抗真菌蛋白的热稳定性(30℃、60℃、100℃加热30min、121℃灭菌20min)、对酸碱的稳定性(pH3.0、5.1、6.2、7.1、8.1、10.0、11.1、12.0)、对蛋白酶的稳定性(分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶、英恒蛋白酶对蛋白进行处理)、紫外线(ukraviolet radiation UV)稳定性(UV，照射时间分别为5、15、25、35、40min)研究，发现在100℃加热30min，使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、英恒蛋白酶处理，UV照射40min，该蛋白仍能保持75﹪以上活性，pH在5.1～10.0时仍有较高活性，中性pH活性最高。 5、蛋白质氮端序列分析和基因克隆。利用该蛋白的热稳定性，将20﹪硫酸铵沉淀获得的蛋白在100℃加热30min后，去除杂蛋白，离心、透析获得纯化蛋白，通过SDS-PAGE初测该蛋白的分子量约36kDa，经上海基康生物有限公司测定，其N端15个氨基酸序列为MRINHNIAALNTTVR，BLAST结果显示，该序列与GeneBank中地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis ATCC 14580)的鞭毛蛋白(flagellin protein Hag，Gene ID：3027788)前12个Aa具有100﹪的相似性。根据保守序列设计引物(上游引物：GGATCCTTTTGCGGCTGTTGGTTC- 下游引物：GTCGACTTCAAGGAGGAAArACACAArG--)，对该蛋白的基因序列进行PCR扩增(变性：94℃ 40s退火：58℃ 30s延伸：72℃ 1min)，产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片断，测序，BLAST，发现该蛋白的基因序列与芽胞杆菌的鞭毛hag基因序列相似性达到99﹪。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1本论文的研究目的和意义

1.2植物内生菌的抗菌机理研究进展

1.2.1植物内生菌在植物病害防治方面的应用

1.2.2植物内生菌对病原菌的作用机制

1.3芽胞杆菌在生物防治中的研究进展

1.4芽胞杆菌的抗菌机理研究进展

1.5细菌鞭毛的研究进展

1.5.1鞭毛的基本特征

1.5.2已发现的鞭毛的功能

第二章芽胞杆菌R21的鉴定

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1芽胞杆菌R21的16SrDNA基因扩增测序及分析

2.2.2传统形态学和生理生化鉴定

2.3 讨论

第三章芽胞杆菌R21生物学特性研究

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2实验结果与分析

3.2.1不同碳源对R21生长的影响

3.2.2不同氮源对R21生长的影响

3.2.3不同pH对R21生长的影响

3.2.4不同温度R21生长的影响

3.3 讨论

第四章芽胞杆菌R21的抗菌谱测定及其对病原菌的作用方式研究

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.2结果与分析

4.2.1热带洋兰中病原真菌的分离

4.2.2 R21的抗菌谱测定

4.2.3 R21对供试菌的作用方式

4.3讨论

第五章抗菌蛋白的分离纯化和性质研究

5.1实验材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.2实验结果与分析

5.2.1硫酸铵分级沉淀法制备抗菌蛋白粗提液

5.2.2滤纸片法检测所得粗提液的抗性

5.2.3拮抗物质的热稳定性

5.2.4拮抗物质对蛋白酶稳定性

5.2.5拮抗物质对pH的稳定性

5.2.6拮抗物质对紫外线稳定性

5.2.7拮抗蛋白的纯化和分子量测定

5.3 讨论

第六章抗菌蛋白基因的获得

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2实验方法

6.2结果与分析

6.2.1抗菌蛋白氮端测序

6.2.2 N端15个Aa序列与Gene bank中蛋白序列比对结果

6.2.3根据氮端测序和比对结果设计引物

6.2.4 PCR扩增抗菌蛋白基因

6.3讨论

总 结

参考文献

致谢

原创性声明