氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵修复与没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗氧化保护作用的研究

摘要

前言
　　DNA双链断裂(DNAdouble-strandedbreaks,DSBs)发生后,哺乳动物细胞将启动一个复杂的蛋白网络对其进行监控及修复:包括细胞周期检验点、DNA损伤修复及凋亡。DNA损伤反应是高度保守的信号感应过程,大致可分为损伤感应、信号传递及信号效应3个部分。损伤感应分子3-磷脂酰肌醇激酶(Phosphoinositide3-kinaserelatedproteinkinase,PI-3K)家族成员针对不同的损伤来源被激活后,迅速聚集到损伤位点,快速磷酸化下游的效应激酶,通过协同作用实现对DNA损伤的高度协调反应。H2AX作为PI-3K家族成员的下游分子,其第139位丝氨酸残基被快速磷酸化后形成γH2AX。后者被认为是DNA损伤修复标志物,而ATM所具有的可被DNA损伤相关的染色质修饰所激活的能力,使其成为PI-3K家族中促使H2AX磷酸化最匹配的激酶。同时,ATM也参与了细胞周期检验点的调控:激活的ATM磷酸化细胞周期检验点激酶Chk1或Chk2,激活的Chk1/Chk2进而顺序磷酸化不同的效应因子,并根据DNA的损伤类型,形成不同的信号通路激活细胞周期检验点(G1/S、S、G2/M),使细胞周期停滞,为DNA损伤修复提供时间。
　　精液冷冻保存是辅助生殖技术(Assistedreproductivetechnology,ART)领域中的重要技术,其冻融过程产生过量的活性氧类物质(Reactiveoxygenspecies,ROS)可致精子氧化应激性DNA损伤。ART应用又使DNA损伤精子受精发育成胚胎的机会增加,尤其是卵细胞浆内单精子注射技术(Intra-cytoplasmicsperminjection,ICSI),由于避开了自然受精过程中多种天然屏障对精子的筛选,增加了DNA损伤精子直接进入卵子的风险。DNA损伤精子仍可受精,但成熟精子丧失自我修复DNA损伤的能力,需依赖受精后受精卵内的修复。而目前关于氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵修复的研究十分有限,进行该方向的研究为完善DNA损伤精子受精后受精卵修复理论无疑具有重大意义。
　　正是由于精子氧化应激性DNA损伤与ROS密切相关,在ART体系中添加抗氧化保护剂以降低ROS引发的氧化应激性损伤可能是提高ART治疗结局的有效途径之一。没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)因具有非常强的抗氧化活性,能够保护细胞和DNA免受损害而作为目前众多抗氧化保护剂中最理想的一种,被尝试添加到体外受精培养体系中,表现出促进胚胎发育的作用,但是其对冻融精子受精卵的保护机制尚不清楚。阐明EGCG对氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵的保护机制,不仅为研究冷冻精子氧化应激性DNA损伤防治措施提供理论依据,也为寻找降低DNA损伤精子遗传风险的策略方法提供了新思路。
　　目的
　　1.初步探讨氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵DNA损伤修复机制。
　　2.初步探讨EGCG对氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵的保护机制。
　　方法
　　1.分别将昆明(KunMing,KM)小鼠精子放入新鲜精子获能液、加1mMH2O2的精子获能液中,5％CO2、37℃培养箱孵育1.5小时左右,得到新鲜精子和氧化应激性DNA损伤精子,调整精子浓度为1-2.5×106个/ml,分别进行体外受精获得正常对照组及氧化应激性DNA损伤组受精卵。采用免疫荧光法检测正常对照组及氧化应激性DNA损伤组原核期胚胎中pSer1981-ATM、pSer345-Chk1及pThr68-Chk2焦点的形成并进行比较。
　　2.依据受精液和胚胎培养液中是否添加EGCG,将氧化应激性DNA损伤组受精卵分两组:未添加组受精液和胚胎培养液中未添加EGCG;添加组受精液和胚胎培养液中均添加了17.5μg/mlEGCG。从受精后16.5小时至23.5小时,分别对未添加组及添加组的受精率、二细胞形成情况及四细胞形成情况进行观察,每小时观察1次,计算受精率、一细胞卵裂率及二细胞卵裂率并进行比较;选择未添加组及添加组上述各观察时间点的受精卵,免疫荧光法检测pSer1981-ATM焦点的形成并进行比较。
　　结果
　　1.免疫荧光法检测各组受精卵中pSer1981-ATM信号,发现正常对照组受精卵中pSer1981-ATM、pSer345-Chk1及pThr68-Chk2均无信号;氧化应激性DNA损伤组中可见较强的pSer1981-ATM荧光信号及pSer345-Chk1荧光信号,pThr68-Chk2则未见明显信号。
　　2.未添加组的受精率、一细胞卵裂率及二细胞卵裂率分别为45.2%、100%及61.5%,添加组的受精率、一细胞卵裂率及二细胞卵裂率分别为44.5%、97.8%及71.3%,添加组与未添加组相比,受精率、一细胞卵裂率及二细胞卵裂率差别均无统计学意义(P>0.05)。从受精后16.5小时至受精后23.5小时,未添加组的一细胞卵裂率依次是21%、34%、68%、86%、89%、91%、96%、98%;添加组的一细胞卵裂率依次是32%、70%、83%、87%、89%、90%、95%、96%;对各个时间点添加组及未添加组的一细胞卵裂率进行比较发现,受精后17.5小时和受精后18.5小时(相当于第一次有丝分裂细胞周期的晚G2期)的一细胞卵裂率差别有统计学意义(P<0.05),其它时间点的一细胞卵裂率差别无统计学意义(P>0.05)。以受精后时间为自变量,一细胞卵裂率为因变量建立函数,以一细胞卵裂率为50%的时间点作为观测点,当一细胞胚胎卵裂率为50%时,未添加组为受精后18.28598小时,添加组为受精后17.10280小时,添加组比未添加组提前约1小时进入分裂。未添加组和添加组pSer1981-ATM荧光信号强度分别为0.008327±0.006603和0.0196±0.010347,差别有统计学意义(P<0.05)。
　　结论
　　1.氧化应激性DNA损伤精子受精后DNA损伤的修复依赖于卵母细胞中储存的mRNA和蛋白质,可能通过ATM启动了受精卵DNA损伤修复机制的同时,ATM还可能激活Chk1启动细胞周期检验点,使细胞分裂发生延迟,从而为修复赢得时间。
　　2.EGCG主要作用于受精后第一个细胞周期,加快受精卵进入卵裂的速度、延长第一次卵裂的持续时间;EGCG可能促进了氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵内ATM介导的损伤修复。

目录

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中文摘要

英文摘要

缩略词表

目录

第一部分 氧化应激性 DNA 损伤精子受精后受精卵修复机制的研究

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 研究对象及分组

2.2 主要试剂及实验仪器

2.3 实验方法

第3章 实验结果

3.1 胰酶消化透明带前后原核期胚胎

3.3 正常对照组和氧化应激性 DNA 损伤组受精卵 pSer1981-ATM 焦点， pSer345-Chk1及pThr68-Chk2 焦点形成情况

第4章 讨论

第5章 结论

第二部分 EGCG对氧化应激性DNA损伤精子受精后受精卵保护机制的研究

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1研究对象及分组

2.2主要试剂及实验仪器

2.3 实验方法

第3章 实验结果

3.1未添加组及添加组受精卵数、二细胞及四细胞形成情况观察

3.2未添加组及添加组受精卵pSer1981-ATM 焦点形成情况

3.3 Image-Pro Plus6.0 软件检测添加组及未添加组受精卵内

第4章 讨论

第5章 结论

展望

参考文献

附录：综述

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间发表的论文及参与的科研活动

个人简历