糖尿病雄性勃起功能障碍大鼠下丘脑区域神经元的代谢特征及催产素能神经元功能改变的研究

摘要

目的：勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）及相关性功能障碍是男性糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者的常见并发症，其发病机制复杂，不仅与阴茎海绵体内血管内皮功能损伤、平滑肌结构和功能改变以及相应外周神经的病变相关，还可能涉及中枢神经系统调控机制的病理改变。下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）是神经系统内控制阴茎勃起和性行为的中枢，主要通过调控催产素能神经元催产素（oxytocin，OT）实现。研究发现，PVN内小细胞OT能神经元所分泌的催产素可通过突触连接直接或间接作用于脑干和脊髓的传出神经元从而调控阴茎的勃起，但在糖尿病状态下PVN内OT能神经元的功能改变及与糖尿病性勃起功能障碍发生发展的病理联系和具体机制尚不明确。氢质子磁共振波谱技术（proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS）是目前唯一的可非侵入检测脑内生化水平的检查技术，可以定量活体动物特定脑区检测代谢物的浓度。本实验的研究目的：1）利用氢质子磁共振波谱技术检测2型糖尿病大鼠下丘脑区生化代谢物的变化特征，初步探究其与糖尿病性勃起功能障碍发生发展的可能联系；2）研究2型糖尿病大鼠下丘脑PVN内与勃起功能及性行为相关的OT能神经元的定位、激活、相关功能蛋白的表达及神经细胞的凋亡情况。本研究通过在体实验，首次从影像学和组织形态学角度探讨糖尿病雄性大鼠性功能障碍的中枢发病机制，将为后续深入研究奠定基础。
　　材料与方法：
　　1.选取40只健康雄性sprague dawley（SD）大鼠，体重180±20g，随机分为糖尿病组（DM）和正常对照组（normal control，NC）。DM组采用高脂高糖饲养联合低剂量链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射诱导建立2型糖尿病模型；NC组则给予正常饲料喂养和腹腔注射同等剂量的STZ缓冲溶液。注射完成72h后检测空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L视为建模成功。此后，每周检测大鼠体重及血糖各一次。建模4周及8周时，利用1H-MRS分别检测DM组及NC组大鼠下丘脑区常用6种代谢物的浓度。建模8周后，处死大鼠并取脑组织用于后续实验分析。
　　2.取冻存的正常大鼠脑组织制备成冰冻切片，用尼氏染色的方法定位PVN的位置，选取细胞密集、特征较为明显的层面用于后续实验研究。
　　3.正常SD雄性大鼠右侧脑室插管并留置一周，于上午清醒状态下注射OT并观察1h内大鼠阴茎勃起的次数及持续时间。OT注射2h后处死大鼠并取脑组织做冰冻切片，利用OT和c-fos免疫组化标记下丘脑室旁核与勃起相关的OT能神经元的位置。
　　4.取步骤1冻存的脑组织并制备成冠状位冰冻切片，应用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）检测大鼠室旁核细胞的凋亡程度。
　　5.比较第2-4步相同层面的切片，观察并计数与勃起相关的OT能神经元凋亡数量。
　　实验结果：
　　1．与对照组相比，DM组大鼠平均体重明显降低，而平均血糖水平显著升高（P<0.05）。
　　2．1H-MRS结果显示，糖尿病建模4周及8周时同时段正常对照组大鼠下丘脑各代谢物浓度无明显差异（P>0.05）。与对照组相比，建模4周及8周时糖尿病大鼠下丘脑区肌醇（myo-inositol，mI）、谷氨酸和谷氨酰胺（glutamate and glutamine，Glu+Gln，Glx）浓度显著升高，且8周时浓度较4周更高（P<0.05）；建模4周及8周时糖尿病大鼠下丘脑区胆碱复合物（choline-containing compounds，Cho）浓度较对照组显著升高（P<0.05），但建模8周和4周时浓度无明显差异（P>0.05）。
　　3．经侧脑室给药注射OT诱导阴茎勃起，取脑组织做OT和c-fos免疫组化，结果显示：大鼠PVN内与勃起相关的OT能神经元主要集中于腹外侧区内缘和第三脑室旁；TUNEL结果显示DMED大鼠PVN内的该类神经元存在凋亡，与对照组相比凋亡指数明显升高（P<0.05）。
　　结论：
　　1.2型糖尿病雄性大鼠下丘脑区域代谢物的水平存在显著异常，且部分代谢物的变化程度随糖尿病病程进展而加剧，提示中枢内神经元的代谢紊乱可能与糖尿病大鼠的室旁核内神经元功能紊乱及性功能障碍的发生发展相关。
　　2.2型糖尿病雄性大鼠下丘脑室旁核内与勃起及性行为调控有关的催产素能神经元过度激活，催产素表达水平下降，细胞凋亡指数升高，以上病理改变可能参与了糖尿病男性性功能障碍的中枢发病机制。

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一、前言

1.1 DMED的流行病学现状

1.2 DMED的外周致病机制

1.3 阴茎勃起的中枢调控机制

1.4 1H-MRS的研究现状

1.5 OT能神经元的凋亡与DMED的关系

1.6 c-fos基因和fos蛋白的作用

1.7 科学假设

二、观察糖尿病性勃起功能障碍大鼠下丘脑六种相关代谢物代谢浓度在不同时段的变化

2.1 材料、试剂与仪器

2.2 试验方法

2.3 实验数据统计分析

2.4 实验结果

2.5 讨论

三、糖尿病性勃起功能障碍大鼠室旁核内催产素能神经元的凋亡与勃起功能变化的关系

3.1 材料

3.2 试验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

结论

参考文献

致谢