恶臭假单胞菌M39降解17β-E2代谢途径初步探究

摘要

随着甾类化合物污染的日益加重，研究甾类化合物的快速降解迫在眉睫。目前对甾类化合物的代谢途径研究中，雄激素睾丸酮代谢途径的研究已经基本完善，而对于雌激素代谢途径的研究尚在初步阶段。因此，本文选择从南海污泥筛选得到菌株M39，进一步研究17β-雌二醇（17β-E2）的代谢途径。所获得的主要研究结果如下：
　　利用生理生化、16S rRNA分子鉴定和扫描电镜等方法，初步确定菌株M39为恶臭假单胞菌属，革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状。
　　菌株M39能够利用17β-E2作为唯一碳源，在第20天生长OD600为0.12，第25天降解率为100％及蛋白含量为50μg/mL。在以17β-E2唯一碳源的培养液中添加1/102216E作为辅助碳源进行培养，发现M39利用17β-E2的降解周期缩短，在第6天生长OD600为0.8，第9天降解率为100%，第8天蛋白含量为800μg/mL。通过GC-MS检测菌株降解17β-E2的代谢中间产物，发现M39以17β-E2为唯一碳源培养6 h后，检测到雌酮（E1）的累积；而M39以E1为唯一碳源培养6 h后，检测到醋酸雌酮（COA-E1）的累积。推测17β-E2先被菌株M39降解为E1，而E1再被降解为COA-E1。
　　通过转录组和基因组测序分析，筛选出17个可能参与M39降解的基因，并对这些基因进行了mRNA相对表达量验证。结果表明，这17个基因可能参与了17β-E2的代谢，其中有12个基因在17β-E2降解初期有上调表达。目前尚未见报道微生物中能降解17β-E2的关键基因，仅有文献推测可能是加氧酶或3β-HSD基因。因此预测111（3β-HSD）、300（3β-HSD）、3131（雌二醇裂环双加氧酶）和4883（雌二醇裂环双加氧酶）可能是M39降解17β-E2降解的关键基因。
　　通过分子克隆技术构建了预测基因的工程菌株并且验证了其降解17β-E2的降解率和代谢中间产物。降解率检测结果表明，111和300基因降解17β-E2降解率分别为17.7%和79.23%；111、3131和4883基因降解E1的降解率分别为28%、89.88%和83%。代谢中间产物检测结果表明，111和300基因将17β-E2转化为E1。此外，111基因将17β-E2的C3位上面的羟基脱去，将17β-E2转化为Estra-1,3,5(10)-trien-17-ol。

目录

声明

缩略语

一、前言

1.1 雌激素污染现状

1.2 雌激素代谢研究进展

1.3 本论文的研究目的与意义

二、材料与方法

2.1 实验材料

2.2 溶液配制

2.3 实验方法

三、结果与分析

3.1 唯一碳源降解17β-E2菌株M39鉴定

3.2. 菌株M39降解17β-E2能力的探究

3.3 菌株M39降解17β-E2的相关基因筛选

3.4. 菌株M39预测降解基因的克隆、功能验证

四、讨论

（1）菌株M39 降解17β-E2 分析

（2）菌株M39 转录组和基因组测序分析

（3）菌株M39 预测基因的功能分析

（4）菌株M39 降解17β-E2 代谢通路分析

总结与展望

总结：

展望：

参考文献

致谢

论文撰写与学术交流

附录