UPLC-MS/MS法测定人血浆中舒芬太尼浓度及舒芬太尼靶控输注系统准确性评估

摘要

靶控输注系统(TCI)是一种研发于30多年前的麻醉药静脉输注系统.靶控输注系统的基本操作原则为:麻醉医生根据所需麻醉深度设定和调节麻醉药物的目标靶浓度.由于手术过程中出现不同程度的手术刺激,阿片类药物的单次推注结合可变速率的输注方式能够更好地维持手术过程中血流动力学稳定,并得到满意的麻醉效果.目前,麻醉医生已经能够根据需要调节靶控输注系统,以求快速达到并维持静脉麻醉药血浆或效应室的目标浓度.
　　 舒芬太尼靶控输注多用于麻醉诱导和术中维持,有多个药代动力学模型可供麻醉医生选择.舒芬太尼是一种高效价的阿片类药物,拥有较强的镇痛效果.不足的是,较长的代谢周期(半衰期)意味着长时间泵注该药物可能出现药物蓄积,苏醒延迟和拔管延迟,从而降低了靶控输注舒芬太尼的可行性.靶控输注模型能够减少围术期长效阿片类药物的蓄积,提高麻醉后病人的苏醒质量.尤其是,舒芬太尼靶控输注系统能够预设一个拔管浓度,在保证高质量镇痛的同时,降低拔管延迟或术后呼吸抑制的风险.该输注系统通常有一个微处理器,用来计算静注药物在达到目标浓度之前所需的输注速率,对于舒芬太尼来说,这样的微处理器能够运行好几种药代动力学模型.
　　 尽管多种药代动力学模型都能够较好地预测舒芬太尼的血浆浓度,但前人在评估输注系统准确性的实验中,常把目标血浆浓度设定为一个或两个固定数值,而实际工作中麻醉药物的血浆浓度往往不是设定在一个数值.并且,精确测量麻醉药物的血浆浓度有助于靶控输注系统准确性的评估.于是,我们认为有必要建立一种高敏快速的定量测量血浆中舒芬太尼浓度的方法.本文的研究目的有二,一是建立新的超高效液相一串联质谱法来测量腹部手术患者血浆中舒芬太尼浓度；二是判断Gepts模型能否准确预测患者血浆中的舒芬太尼浓度.
　　 材料和方法
　　 1.实验对象的选择:该实验已获得当地医学伦理委员会批准,并在术前已告知17名非肥胖成年患者.实验对象的排除因素有:年龄<20岁或>60岁,ASA分级Ⅳ或Ⅴ级,酒精成瘾史,药物成瘾史,阿片类药物过敏史,精神异常,妊娠,肝、肾、肺功能不全,参与其它临床试验等.
　　 2.麻醉过程:患者行择期腹部手术,如妇科或胃肠道肿瘤切除和/或淋巴结清扫术.麻醉诱导采用Gepts参数给予舒芬太尼靶控输注,并常规使用非阿片类麻醉药物.术中为保持血流动力学稳定,麻醉医生根据手术刺激的强度提前调整舒芬太尼靶控输注的目标血浆浓度,从0.06到0.8 ng/ml不等.不同强度的手术刺激依次为:清醒,意识消失,喉镜反射消失,气管插管,切皮,腹腔探查,缝皮和自主呼吸.
　　 3.样品采集:当预设血药浓度达到目标浓度5 min后,抽取动脉血,装入肝素抗凝采集管.离心15 min(3℃,3000 rpm),取上清液1.0 ml移入Ep管,-80℃保存.收集足够标本后集中复融,再次离心以各样品提取.
　　 4.样品提取
　　 (1)样品前处理:去蛋白前将880μl血清与20μl内标液(芬太尼,2.5 ng/ml)和100μl％氨水混合均匀.
　　 (2)固相萃取小柱的预处理:用1 ml纯甲醇和1 ml纯水先后湿润萃取小柱.
　　 (3)上样:将1 ml含有内标液和氨水的血清样品加入固相萃取小柱.
　　 (4)洗脱:用1 ml1％甲醇和1 ml纯甲醇洗脱萃取小柱.
　　 (5)干燥:真空干燥24 h.
　　 (6)进样前处理:用1 ml流动相溶解干燥后的样品,离心后取10μl上清液注入UPLC系统.
　　 5.舒芬太尼血药浓度的检测
　　 5.1.色谱和串联质谱:美国Waters公司ACQUITYTM超高效液相色谱仪,美国Waters公司MicromassQuattro Premier串联质谱仪,配备电喷雾离子源(ESI,electrospray ionization)以及MassLynxTM NT4.1数据采集软件.
　　 5.2.标准溶液的配制:配制相当于舒芬太尼质量浓度为0.071,0.142,0.235,0.570,1.140,2.280和4.560 ng/ml的血浆样品,及相当于芬太尼质量浓度为2.5 ng/ml的血浆样品,制备标准曲线,以上溶液均-4℃.
　　 5.3.生物分析方法的评估:根据美国食品药品监督局(FDA)对生物样品分析要求,从以下几个指标评估本实验使用的液质联用方法:专属性、线性、准确度和精确度、回收率、基质效应和稳定性.
　　 6.靶控输注系统预测血浆内舒芬太尼浓度的准确性评估
　　 6.1.研究对象间的比较
　　 (1)执行误差(PE)表示实测浓度与相应点预设浓度的误差；
　　 (2)执行误差的中位数(MDPE)表示系统的偏离度；执行误差绝对值的中位数(MDAPE)用来衡量系统的准确度；
　　 (3)系统的摆动度(wobble)用中位绝对偏差(MDADPE)表示,代表PE的易变性；
　　 (4)系统的分散度(divergence)为泵注期间的APE线性回归的斜率,用于评估系统的准确度.
　　 6.2.研究对象内的比较
　　 (1)随时间变化Cm/Cp比值的变化趋势(Cm:measured concentrations,实测浓度；Cp:predictive concentrations,预设浓度).
　　 (2)随时间变化,个体患者(PEij-MDPEi)回归线.该回归线表示,随着时间的延伸,个体患者PEi的变化趋势.
　　 (3)随时间变化个体患者PEij与MDPEi之间的差异.该曲线表示,TCI输注期间,个体患者的执行误差.
　　 6.3.模型间的比较:与多数研究舒芬太尼靶控输注模型的实验所不同的是,我们的实验是在多次改变目标血浆浓度的条件下检测所使用的药代动力学模型,以评估该模型的准确性.在Slepchenko等人的研究中,他们针对肥胖患者建立了一种非线性混合模型,目标血药浓度设定在0.3至0.65 ng/ml范围内.于是我们将这两种在多个目标血浆浓度下运行的模型进行准确度比较.
　　 结果
　　 1.样品提取:本实验验证了固相萃取能够成功地提取血浆中微量的舒芬太尼.
　　 2.液质联用方法的评估
　　 (1)专属性:血浆性内源物质不干扰舒芬太尼的测定.
　　 (2)线性:记录样品、内标峰面积,以样品峰面积与内标峰面积比值对浓度作线性回归,得出回归方程为y=-0.02965+0.5515 x,r2>0.999,所得方程在0.07至4.56 ng/ml内线性良好。
　　 (3)准确度和精确度:制备舒芬太尼3个浓度的QC样品(0.071,0.57 and4.56 ng/ml),分析日内差异和日间差异,RSD均小于15％.
　　 (4)回收率和基质效应:计算舒芬太尼和内标(芬太尼)回收率,结果接近80％,表明基质效应较小,没有共同析出的物质影响分析物和内标的测定.
　　 (5)稳定性:结果表明舒芬太尼在血浆样品中有较好的稳定性.
　　 3.预设浓度的准确性评估
　　 3.1.实验对象间的比较:通常认为MDAPE在20-30％之间可以应用于临床.因此,本实验使用的Gepts参数能够准确地调整舒芬太尼血浆浓度,能够完成手术中多次变换目标浓度的要求.
　　 3.2.实验对象内的比较
　　 (1)随时间变化Cm/Cp比值的变化趋势.多数曲线位于基线之上,这意味着对于多数患者而言,实测舒芬太尼浓度大于输注泵预设的浓度.
　　 (2)随时间变化的个体患者的(PEij-MDPEi)回归线.本实验个体患者的(PEij-MDPEi)回归线的斜率多为负值,表明随着时间的变化,Gepts系统能够降低Cm和Cp之间的差异.
　　 (3)随时间变化个体患者PEij与MDPEi之间的差异.曲线群基本围绕O位点延伸,提示对每个患者而言,Gepts系统基本上能够准确靶控血浆舒芬太尼浓度.
　　 3.3.模型间的比较:Gepts参数和Slepchenko’s参数在预测血药浓度时均具准确性,而Slepchenko系统的摆动度(Wobble)较小.
　　 结论
　　 1.本实验建立了一种高敏UPLC-MS/MS方法来定量检测舒芬太尼血药浓度.
　　 2.在多次变换目标浓度的条件下,Gepts参数引导下的靶控输注系统能够准确地预测舒芬太尼的血药浓度.