直肠异常隐窝病灶(ACF)中Hedgehog信号通路的活性改变及其对结直肠癌预警作用的研究

摘要

背景和目的:大肠癌是严重危害人类健康的十大肿瘤之一,近年来我国发病率有逐年上升的趋势。早期大肠癌常无明显症状,一旦确诊多属中晚期。因此如何发现早期大肠癌,提高早期大肠癌的检出率,已成为消化系疾病中亟待解决的问题[1]。因此,加强对早期大肠癌的诊治和对高危人群的普查,做到早发现、早诊断、早治疗,对提高生存率有重大意义。
　　 异常隐窝病灶(aberrant crypt foci,ACF)是Bird用实体镜于1987年在大肠癌的动物模型中首先发现的[2.3],目前被认为是光镜下所能看到的最早期的结、直肠癌前病变。常规内镜操作难以看到,但应用亚甲兰或靛胭脂染色,即使在普通内镜下都能显示[4,5]。通常把单个或聚集成灶的异变腺窝称为异常隐窝病灶,异变腺窝不同于正常肠腺之处在于:腺管染色加深,面积扩大；管腔口呈椭圆、锯齿状、裂隙状等；上皮层增厚,轻微隆起[6]。根据病理ACF主要分为异型性及非异型性两类。作为镜下可见的最早的大肠癌前病变,人们把ACF作为结直肠癌的早期诊断观察指标之一[7-9]。目前ACF是最早的结直肠癌前病变的假设正为人们慢慢接受,但是这些病变与肿瘤发生的关系仍不十分清楚,目前国际上大样本的研究较少,国内,我科于2007年针对ACF与结肠肿瘤的的关系进行了初步研究[10],发现直肠有ACF的患者发生肠道肿瘤及高危肿瘤的概率较无ACF者明显升高,其OR(95％CI)分别为22.352(6.716—74.395),7.982(1.838—34.672)。癌和腺瘤患者直肠ACF发生率(90.7％&75.0％)较无病变者(41.9％)显著增高(p<0.001)。
　　 Hedgehog(Hh)基因于1980年首先由Nusslein-Volhard C在对筛选可能引起果蝇突变的基因时发现[11]。在哺乳动物中Hh信号通路在器官发育,维持成熟组织的内环境稳定,慢性炎症中的组织修复和癌症发生等多种进程中发挥重要作用[2]。近年来的研究发现,Hh信号通路可能在成体组织中再度激活,从而在肿瘤发生中起重要作用[13-18]。
　　 Hh有三种同分子体配体:Sonic hedgehog(SHH),Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH),其中对SHH的研究最多,主要是因为传统观点认为:SHH在各种组织中均有表达,SHH的实验结果通常适用于Hh的其它同分子(IHH、DHH)[19]。但是,最近的研究结果对Hh三种同分子体的功能重叠性提出了质疑,有研究表明,在肿瘤形成过程中,IHH并不是SHH的功能同系物[20,21]。SHH和IHH在胃肠道早期发育的几个关键过程中是必需的[22],结肠中主要表达这两种形式的配体[23]。有报道发现PTCH1作为HH信号通路的抑癌基因,在肿瘤的发生过程中发现该基因启动子区发生甲基化的现象,而Hh配体结合跨膜受体Patched-1(PTCH1)后,释放PTCH1介导抑制的Smoothened(SMO)受体。SMO阻遏解除使GLI锌指转录因子激活并转入核内,促进Hh靶基因的转录[24]。脊椎动物有3种GLI,即GLI-1、GLI-2和GLI-3,是Hh信号通路的最终效应分子,其中GLI-1激活大部分Hh信号通路靶基因的转录,其本身也是Hh信号通路的靶基因[24-26]。肿瘤中Hh信号通路的异常激活主要是通过基因突变(配体非依赖性)或配体高表达(配体依赖性)实现的[27]。文献报道,PTCH1、SMO、Suppressor of Fused(SUFU)基因突变与基底细胞癌、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤中Hh信号通im路的激活有关[28]。另一方面,在一些消化道肿瘤中发现了该通路的配体依赖性激活,包括:肝癌[29]、胰腺癌[30]、食管癌、胃癌、胆管癌[31]。此外,消化道肿瘤中很少发现Hh通路组成成分的突变,提示消化道肿瘤中Hh信号通路的激活是配体依赖性的[31]。
　　 目前由于放大内镜、染色技术的限制以及对人群进行问卷调查的复杂性使得大样本进行ACF的研究并不多。对ACF流行病学及ACF的特点(如数目、组织学分级、大小)与被观察者的特征(如年龄、性别、既往史情况等)之间关系的研究数量有限。清楚ACF在人群中的分布情况及其危险因素将更有助于我们了解其生物学特性。本次研究的目的是通过问卷调查、内镜下直肠异常隐窝病灶(ACF)的数目计数结合内镜及病理结果统计及在结肠镜检查为基础的人群中直肠ACF的均数及发生率,并探讨直肠ACF对结直肠进展型腺瘤及肠癌的预警作用,分析筛选出对其有显著意义的危险因素。
　　 Hedgehog信号通路在结直肠肿瘤中的确切作用已经有过大量的研究,即该通路在CRC中有研究表明是激活的,那么作为结直肠肿瘤的前身ACF中Hedgehog信号通路的调节机制尚未有报道,因此,阐明Hh信号通路在ACF中的作用及其调节机制,渴望对结直肠癌的预警及治疗带来新的发现。
　　 材料和方法
　　 一、直肠ACF对结直肠癌预警作用的研究
　　 1.病人及纳入标准:于2009年3月-2009年9月在南方医院消化内镜中心接受全结肠镜检查的患者中召集自愿填写危险因素调查问卷并接受直肠染色放大观察的患者574例,排除溃疡性结肠炎、直肠炎症或溃疡较重影响染色观察者、家族性息肉病、直肠切除手术术后患者,符合条件的患者共501例,其中有直肠ACF的患者405例。
　　 2.问卷调查:对接受直肠染色观察的患者进行自填式问卷,对填写不完整者进行电话问卷补充。问卷内容包括基本的人口统计学信息及性别、年龄、结肠镜检查指征、结直肠癌病史。
　　 3.肠镜检查及直肠粘膜染色:所有患者肠道准备为聚乙二醇电解质散,加水2000ml口服,或加行清洁灌肠至排出水样便。在结肠镜检查退镜时用50ml蒸馏水冲洗直肠粘膜,将0.4％靛胭脂用喷洒管喷洒到粘膜表面,吸去多余染色剂后,计数直肠ACF数目。应用放大内镜进行ACF的识别。ACF定义:腺管染色加深,面积扩大；管腔口呈椭圆、锯齿状、裂隙状等:上皮层增厚,轻微隆起。观察ACF,同时进行照片记录,同意进行活检的病人,对其中直径较大的(≥3mm)ACF进行活检钳除。根据直肠ACF数目将病人分级,0级:0个,Ⅰ级:1-4个,Ⅱ级:5-9个,Ⅲ级:10个及以上。ACF的判定严格按照其定义进行。检查完毕后,实验者记录内镜检查号,结肠病变情况(部位,大小,形态),直肠ACF数目及肠道其它病变(大小,形态),病理检查号,病理结果。
　　 4.病理学诊断:根据世界卫生组织标准对腺瘤进行诊断并确定其瘤变程度,根据细胞的异型程度及是否存在腺体结构异常将瘤变程度分为低级别及高级别上皮内瘤变。低级别瘤变包括轻、中度异型改变的腺瘤,高级别瘤变腺瘤包括重度非典型增生及原位癌。当组织学发现瘤变穿过粘膜肌层,到达粘膜下层时确诊为癌变。所有病理切片均由两位病理医师双盲阅片诊断,如有异议由第三位病理医师进行诊断。对活检的ACF标本,部分应用10％福尔马林固定后,石蜡包埋,HE染色:部分保存于-80℃冰箱。ACF分为异型性、非异型性两类。
　　 二、Hh信号通路在直肠ACF中的活性研究
　　 1.收集直肠ACF标本:每例标本分为两部分:一部分立即液氮冷冻,-80℃保存备用；另一部分10％福尔马林固定,石蜡包埋。
　　 2.采用荧光定量RT-PCR方法,检测直肠ACF组织中信号通路关键分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1 mRNA的表达水平。
　　 3.采用免疫组织化学方法,检测直肠ACF中SHH、PTCH1、SMO、GLI1中蛋白质的表达,并采用半定量的方法对组织化学染色进行评分。
　　 4.甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)采用MSP方法,检测原发性肿瘤组织中PTCH1基因的甲基化状态。亚硫酸盐修饰后的DNA作为MSP的模板,采用对甲基化或非甲基化序列特异的引物进行扩增。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上分离,EB染色,紫外灯下成像观察。
　　 5.甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析(MS-HRM):是一种不需要PCR产物后续操作的,简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法主要通过比较曲线的熔解温度和峰形得以实现并且可以在一些列的CpG位点中检测出单一的一个甲基化的发生,同时,也可以对一系列的CpG位点的甲基化水平进行分析。单个CpG位点的甲基化和平均的甲基化水平会对熔解曲线的形状造成影响。采用重亚硫酸盐处理DNA模板可以使5.甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶。在PCR反应前,在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物,这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛,一旦这些CpG岛发生甲基化,使胞嘧啶(C)不发生变化,而与未甲基化的胞嘧啶(C)转变成胸腺嘧啶(T),样品中的GC含量发生了变化,最终被转化成了熔解曲线Tin值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响,因此,根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度。检测抑癌基因PTCHl的甲基化频率。
　　 三、统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析。计数资料以百分比(％)表示。分类变量两组间比较采用X2检验或Fisher精确概率法,P≤0.05差异有统计学意义,所有检验均为双侧。
　　 结果
　　 1.直肠ACF对结直肠癌的预警作用直肠有ACF的患者发生肠道高危肿瘤及进展期结直肠癌的概率较无ACF者明显升高,其OR(95％CI)为2.606(1.260—5.388),(x2=7.103,P=0.006)；男性患者发生ACF的概率较女性患者升高,其OR(95％CI)为1.683(1.075—2.636),(x2=5.244,P=0.027)；年龄大于40岁的患者发生ACF的概率高于40岁以下的患者,其OR(95％CI)为4.151(2.579—6.679),(x2=37.557,P<0.001)。
　　 2.根据组织学特点,ACF被分为不典型增生(dysplastic ACF,d-ACF)和非不典型(non—dysplastic ACF,n—ACF)两种,其中非不典型增生又包括正常和增生两种。在活检所得的405例ACF标本中,54(13.3％)个伴有不典型增生,351(86.7％)个非不典型增生,其中139(34.3％)个伴有增生,而剩余的212(52.3％)个则既不伴有增生也无不典型增生。
　　 3.性别为女性是进展型腺瘤的保护因素(P,0.002；OR,0.439:95％CI,0.260-0.742),年龄为进展型腺瘤危险因素(P,0.012；OR,2.755；95％CI,1.247-6.089)。有ACF是进展型腺瘤的危险因素(P<0.001；OR,1.866；95％CI,1.452—2.397)。
　　 4.直肠ACF中Hh信号通路SHH、PTCH1、SMO、GLI1中蛋白质的表达SHH蛋白在d-ACF中61.1％(33/54)为细胞浆染色,而在n-ACF中多为细胞膜染色72.1％(253/351),(P<0.001):PTCH1蛋白在d-ACF中85.2％(46/54)为阴性表达,而在n—ACF中大部分为阳性表达,为63.096(221/351),(P<0.001):SMO蛋白在直肠d-ACF中,阳性表达,约74.1％(40/54),而在n—ACF中多为阴性表达,占98.6％(346/351),(P<0.001)。GLI1蛋白在直肠d-ACF中,多为阳性表达,约66.7％(36/54),而在n—ACF中多为阴性表达,占68.4％(240/351),(P<0.001)。
　　 5.SHH mRNA水平在直肠d-ACF中多数高于其正常组织,占66.7％(36/54),在n—ACF中75.0％(36/48)的标本mRNA水平低于其正常组织,(P<0.001)；SMO mRNA水平在直肠d—ACF中多数高于其正常组织,占61.1％(33/54),在n-ACF中91.7％(44/48)的标本mRNA水平低于其正常组织,两组差异有统计学意义(P<0.001)；GLI-1 mRNA水平在直肠d-ACF中多数高于其正常组织,占72.2％(39/54),在n-ACF中87.5％(42/48)的标本mRNA水平低于其正常组织,经fisher’s exacttext检验,(P<0.001)；PTCH1 mRNA水平在直肠d-ACF中多数低于其正常组织,占66.7％(36/54),在n—ACF中83.3％(40/48)的标本mRNA水平高于其正常组织,经fisher’s exact text检验,两组差异有统计学意义(P<0.001)。
　　 6.MSP检测直肠ACF组织中PTCH1甲基化结果分析:
　　 PTCH1在直肠d—ACF组织中大多数发生了甲基化,占64.8％(35/54),而在n—ACF中只有18.8％(9/48)发生甲基化,经fisher’s exact text检验,(P<0.001):
　　 7.MS-HRM检测直肠ACF组织中PTCHl甲基化结果分析:
　　 在直肠d-ACF组织中大多数发生了甲基化,占63.3％,而在正常组织中只有26.7％发生甲基化,PTCH1在d-AcF中发生甲基化频率高于其对应的正常组织中,两组差异有统计学意义(P=0.009)8、直肠ACF组织中PTCH1启动子甲基化和mRNA表达的关系在28/54(51.9％)例d-ACF组织中检测到PTCH1基因启动子甲基化,且这28例组织中PTCH1mRNA均为低表达。直肠d-ACF中mRNA低表达组与高表达组的甲基化率存在显著差异,高表达组甲基化率更低(P=0.007)；直肠d-ACF中mRNA的表达与PTCH1的甲基化有显著关联性(Contingency Coefficient:C=0.358,P=0.005)。在大多数n—ACF组织中,PTCH1基因启动子没有检测到甲基化。
　　 结论
　　 1.直肠ACF发生率随年龄升高有增加的趋势,病变组直肠ACF发生率高于无病变组,男性组高于女性组。结直肠进展型腺瘤患者更易于出现直肠ACF,直肠ACF对结直肠癌及进展型腺瘤有预警作用。
　　 2.配体依赖性Hh信号通路在直肠d-ACF中被激活,可能会引起CRC的发生。加强临床随访是非常有意义的。
　　 3.PTCH1在直肠d-ACF中的表达降低主要与其启动子高甲基化有关,为结直肠肿瘤的治疗提供新的靶点。