CD8+CD28+/CD8+CD28-T细胞免疫平衡与脾虚型炎症性肠病的相关性

摘要

背景:炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)及克罗恩病(CD),是一种难治的慢性非特异性肠道炎症,曾经被认为“不是癌症的癌症”。国外有报道认为IBD的患病率大约为100～200/10万人,国内资料显示UC发病率大约为11.6/10万人。令人担忧的是,不论在欧美还是亚洲,包括中国在内的多数国家的UC发病率均呈上升趋势,且有年轻化倾向。因此IBD的防治应引起医学界的足够重视。
　　 目前IBD的发病机制还未完全阐明,但已明确其与遗传、环境及感染因素有关,且近年越来越多的研究表明免疫因素可能是IBD发病机制最为重要的因素。T细胞免疫是IBD发病机制的重要部分,且已有研究表明不同的T细胞亚群在IBD的发病、转归、预后起到不同的作用。近年对IBD的CD4+T细胞亚群的研究已经比较成熟,这包括辅助性T细胞1型(Th1)及2型(Th2)。除CD4+T细胞外,CD8+T细胞是另一个重要的T细胞亚群。CD28分子是T细胞活化的主要共刺激受体分子,在T细胞的活化、增殖及功能执行等多个环节起到重要作用。根据CD8+T细胞表面是否表达CD28分子,可分为CD8+CD28+杀伤性(又称细胞毒性)及CD8+CD28-抑制性(又称调节性)T细胞亚群两种。我们在前期临床研究发现,IBD患者的CD8+CD28+T细胞含量降低,而CD8+CD28-T细胞含量升高,导致CD8+CD28+/CD8+CD28-比值降低,关于这一比值降低在IBD发病的作用,目前国内外尚缺少类似的报道,因此有必要探讨CD8+CD28+与CD8+CD28-T细胞在IBD发病中所起的作用,以进一步完善IBD的T细胞免疫学机制。
　　 由于西医尚未明确IBD的确切病因,于是西医治疗IBD存在诸多瓶颈,在这种情况下求助于中医药是大势所趋,故从中医药的角度探讨IBD的病因病机对提高IBD的诊治水平具有重大意义。辨证是中医治病的基本思维模式。中医学研究发现脾虚是IBD最为常见的证型之一,尤其对于缓解期的IBD患者,脾虚证更为多见,而缓解期的脾虚状态如得不到有效的纠正,可能会致使病情加重而演变为活动期,因此IBD患者的脾虚状态应该得到足够的重视。
　　 关于脾虚证,目前已有研究发现其与多个系统相关,最直接的是消化系统,其次为免疫系统。为此,我们观察了脾虚与免疫的关系,并发现脾虚患者的CD8+CD28+T细胞同样低于健康组,而CD8+CD28-T细胞高于健康组,且脾虚患者CD8+CD28+/CD8+CD28-T细胞比值的下降程度更为明显。这给我们一个极度重要的提示:不论对于IBD抑或脾虚证,CD8+CD28+/CD8+CD28-T细胞平衡都扮演重要角色,可能是连接IBD与脾虚证之间的一座重要桥梁,但目前仍然缺乏对该方面的深入探讨。因此,深入研究CD8+CD28+/CD8+CD28-T细胞平衡将有助于深化IBD的发病机制认识,并且将中医脾虚证的理论应用于IBD的治疗,这对IBD的防治具有重大意义。
　　 免疫学研究一个细胞或者亚群的功能,可以从以下几个方面切入:1)表面标志:通过CD8及CD28分子可以对CD8+T进行识别和定位,以利于后续的功能研究；2)细胞因子:是由免疫细胞分泌并且可以对自身或者其他免疫细胞实现调节的蛋白质分子,研究表明白介素IL-7、IL-12p40、IL-13及IL-15等细胞因子在CD8+T的增殖分化起到重要作用,并且在不同的疾病所起的作用也有所不同,从而形成复杂的免疫调节网络,在IBD的研究当中,涉及到以上4个细胞因子的研究较少因此有待探讨；3)信号通路:是表达于免疫细胞胞膜表面的重要蛋白质,在传递细胞间通讯信息中起到极其重要的作用,研究表明JAK3-STAT6信号通路在IBD发病机制起到重要作用,但以上两个信号蛋白与IBD的CD8+T免疫关系尚不清楚,因此有待探讨；4)转录因子:是指分布于细胞核里面的蛋白质,其被激活后可以进行转录,从而调节细胞因子的转录与翻译。综合上述,分别从表面标志、细胞因子、信号通路及转录因子4个方面探讨CD8+CD28+T细胞及CD8+CD28-T细胞在脾虚型IBD发病机制的作用,将会使我们更进一步了解脾虚证IBD的免疫学本质。
　　 目的:探讨CD8+CD28+杀伤性T细胞及CD8+CD28-抑制性T细胞以及两者之间的平衡在脾虚型IBD发病机制所起的作用。
　　 方法:通过人体及动物实验对以上问题进行探讨
　　 一、临床研究
　　 1.分组依据国家中医药管理局颁布的中医证候入选标准,结合IBD的诊疗指南,对UC及CD患者进行辨证分型,将观察对象分为以下4个组:健康组(H1组,n=15,主要为健康体检者)、单纯脾虚组(H2组,n=16,主要为具有脾虚证候的肠易激综合征及普通结肠炎而需要接受肠镜检查的患者)、非脾虚型IBD组(H3组,n=19,包括湿热、血虚、肾虚型等证候)及脾虚型IBD组(H4组,n=22,为具有脾虚证候的UC及CD患者)。H3及H4组的IBD患者均属于缓解期；分别收集以上4组观察对象的外周血,并在肠镜检查时采集结肠组织黏膜。
　　 2.表面标志检测使用流式细胞术检测以上4组观察对象外周血CD8+CD28+杀伤性T细胞与CD8+CD28-抑制性T细胞的百分含量；使用免疫荧光(激光共聚焦免疫组化法)检测结肠黏膜CD8与CD28分子双阳性细胞的含量。
　　 3.细胞因子
　　 首先使用高通量蛋白芯片筛选人体血清存在差异的细胞因子,随后使用血清ELISA法对目标细胞因子进行定量检测。
　　 4.信号蛋白
　　 使用western blot检测结肠组织匀浆的转录因子JAK3及STAT6的含量；使用免疫组化SP法检测结肠组织JAK3及STAT6蛋白的表达情况。
　　 5.转录因子
　　 使用western blot对结肠组织匀浆的活化T细胞核转录因子(NFATc2)及细胞因子特异性转录因子3(GATA3)的含量；使用免疫组化SP法检测结肠组织以上两个转录因子的表达情况。
　　 6.统计学方法定量资料用((x)±s)表示,首先对数据进行正态分布及方差齐性检验；外周血及结肠两种不同标本来源所测的杀伤性、抑制性以及杀伤性/抑制性T细胞结果的比较采用两因素方差分析(two-way ANOVA,其中two way包括分组及标本来源两个因素,分组因素有4个水平,标本因素为外周血及结肠共2个水平)；当方差不齐时用Tamhane's T2法比较组间的两两差异。采用SPSS13.0统计软件包分析数据,当P<0.05认为差异具有统计学意义。
　　 二、动物实验研究
　　 1.分组动物的研究包括脾虚以及湿热两种证型,造模方法如下:1)脾虚造模:通过灌服番泻叶煎剂诱发大鼠腹泻,并采用游泳法使大鼠体力耗竭,最终造出构建脾虚证大鼠；脾虚造模后,通过灌服10％D-木糖溶液,并行尾静脉采血,使用检测血清D-木糖含量判断脾虚的程度。2)湿热造模:采用高糖高脂饲料喂养,并置入高温高热高湿度的人工气候箱内,从而构建大鼠湿热体质模型。在证型造模的基础上使用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠诱发UC,分别造成脾虚型及湿热型UC大鼠模型(由于克罗恩病的大鼠模型不易建立,因此构建溃疡性结肠炎模型代表炎症性肠病模型)。造模成功后共分为4个组:空白对照组(R1组,n=15)、单纯脾虚组(R2组,n=14)、湿热型UC组(R3组,该组代表非脾虚UC组,n=12)及脾虚型UC组(R4组,n=13)。采集以上大鼠的外周血及结肠组织进行相应检测。
　　 2.表面标志检测使用流式细胞术检测以上4组大鼠外周血CD8+CD28+杀伤性T细胞与CD8+CD28-抑制性T细胞的百分含量；使用免疫荧光(激光共聚焦免疫组化法)检测结肠黏膜CD8与CD28分子双阳性细胞的含量。
　　 3.细胞因子
　　 首先使用高通量蛋白芯片筛选人体血清存在差异的细胞因子,随后使用血清ELISA法对目标细胞因子进行定量检测。
　　 4.信号蛋白
　　 使用western blot对结肠组织匀浆的转录因子JAK3及STAT6的含量；使用免疫组化SP法检测结肠组织JAK3及STAT6蛋白的表达情况。
　　 5.转录因子
　　 使用western blot对结肠组织匀浆的转录因子NFATc2及GATA3的含量；使用免疫组化SP法检测结肠组织NFATc2及GATA3蛋白的表达情况。
　　 6.统计学方法所采用的设计类型及数据分析方法与上述临床研究类似。
　　 结果:
　　 一、人体实验
　　 1.外周血CD8+CD28+及CD8+CD28-数量:通过流式细胞术检测,发现H4组患者外周血CD8+CD28+杀伤性T细胞含量明显低于另外三组(P=0.000),CD8+CD28-抑制性T细胞含量明显高于另外三组(P=0.000),且H4组CD8+CD28+/CD8+CD28-比值明显低于另外三组(P=0.000)。
　　 2.结肠黏膜CD8及CD28分子表达:尽管四组间CD8+CD28+杀伤性T细胞含量无统计学差异(P=0.064),但H4组该亚群明显低于H1组；H4组CD8+CD28-抑制性T细胞含量明显高于另外三组；H4组的CD8+CD28+/CD8+CD28-明显低于H1组。免疫荧光显示结肠CD8蛋白及CD28蛋白呈不同程度阳性荧光,定位仍以细胞膜为主,个别可呈细胞浆甚至核染色,且两个蛋白的分布表现出较明显的异质性,呈弥散、小片状或灶性分布,且染色的强度亦不一致。
　　 3.细胞因子:高通量蛋白芯片显示多种细胞因子存在差异性表达,在这些细胞因子中选取与CD8+T细胞密切相关的白介素IL-7、IL-12p40、IL-13及IL-15作为重点观察对象并使用血清ELISA进行定量检测,结果显示:
　　 (1)IL-7:四组间的IL-7含量有统计学差异(P=0.002),其中H4与H3组的IL-7含量相当(P>0.05),但此两组均显著低于H1及H2组(P<0.05),且H1及H2组IL-7含量无统计学差异。
　　 (2)IL-12p40:四组间的IL-12p40含量差异具有显著性(P=0.010),其中H4显著高于H1组,而H1显著低于H2组,其余组间比无统计学差异。
　　 (3)IL-13:四组间的IL-13含量有统计学差异(P=0.000),其中H4显著低于H1及H2组,且H3组亦明显低于H1组,但H3与H4组无统计学差异。
　　 (4)IL-15:除H4组IL-15显著高于H1组以外,其余组间两两比较无统计学差异,且四组的差异无显著性(P=0.137)。
　　 4.信号蛋白
　　 4.1 JAK3信号蛋白 Western blot显示JAK3蛋白的相对含量依次为H1>H2>H3>H4,组间有统计学差异(P=0.036),经与内参进行比较,发现H4组JAK3蛋白含量明显低于H1组及H2组。免疫组化SP法染色均显示四组间的JAK3抗原染色由浓及淡的顺序依次为H1>H2>H3>H4,总体有统计学差异(P=0.006),经两两比较发现H4组JAK3抗原染色含量明显低于H1组及H2组。
　　 4.2 STAT6信号蛋白Western blot显示STAT6蛋白的相对含量依次为H1>H2>H3>H4,组间有统计学差异(P=0.042),经与内参进行比较,发现H4组STAT6蛋白含量明显低于H1组及H2组。免疫组化SP法染色均显示四组间的STAT6抗原染色由浓及淡的顺序依次仍为H1>H2>H3>H4,总体有统计学差异(P=0.010),经两两比较发现H4组STAT6抗原染色含量明显低于另外三组。
　　 5.转录因子
　　 5.1 NFATc2:Western blot显示NFATc2蛋白的相对含量依次为H4>H3>H2>H1,组间差异具有显著性(P=0.028),经与内参进行比较,发现H4组NFATc2蛋白含量明显高于H1组及H3组。但免疫组化SP法染色均显示四组间的NFATc2抗原染色浓度无统计学差异(P=0.140)。
　　 5.2转录因子GATA3:Western blot显示GATA3蛋白的相对含量依次为H4>H3>H2>H1,组间差异具有显著性(P=0.026),经与内参进行比较,发现H4组GATA3蛋白含量明显高于H1组及H2组(图21)。免疫组化SP法染色均显示四组间的GATA3抗原染色由浓及淡的顺序依次仍为H4>H3>H2>H1,总体有统计学差异(P=0.038),但两两比较仅显示H4显著低于H1组,其余两两比较无统计学差异。
　　 二、动物实验
　　 1.大体情况
　　 (1)一般情况
　　 1)体重:造模后,R2～R4组大鼠体重均明显下降,且R4组大鼠下降最为明显,显著低于另外三组(P=0.000),但R2及R3组体重无统计学差异。
　　 2)进食量:造模后R2～R4组大鼠进食量均明显减少,且R4组明显少于R1及R2组,造模后四组的进食量的组间差异具有统计学意义(P=0.010)。
　　 3)饮水量:造模后R4组饮水量明显少于R1及R2组,四组的饮水量的组间差异具有统计学意义(P=0.048)。
　　 (2)肉眼及病理学改变灌肠造模后,R2～R4组分别有2、3及3只大鼠在造模后48h内死于肠穿孔,其余52只大鼠存活至实验结束；解剖大鼠可见肠扩张明显,切开肠壁可见结肠组织溃疡、充血、水肿明显；病理学检查可见典型的“V”型溃疡及炎症细胞浸润。
　　 2.血清D-木糖及IL-6
　　 (1)血清D-木糖经脾虚造模,四组大鼠D-木糖的组间差异具有统计学意义(P=0.049),其中R2组的D-木糖含量明显低于R1组,且R4组同样显著低于R1组,但R3组D-木糖含量与R1组无统计学差异,说明D-木糖相对脾虚而言较特异。
　　 (2)血清IL-6经湿热UC造模,R3组血清IL-6显著高于另外三组(P=0.001),而R4组仅轻度高于R1及R2组,且R1与R2间无统计学差异,说明血清IL-6相对湿热而言具有特异性。
　　 3.杀伤性及抑制性T细胞表达含量
　　 3.1 外周血总体而言,大鼠杀伤性与抑制性的变化情况恰好与人体相反,具体如下:
　　 (1)杀伤性T细胞:四组大鼠CD8+CD28+杀伤性T细胞有显著性差异(P=0.000),其中R4显著高于另外三组。
　　 (2)抑制性T细胞:四组大鼠CD8+CD28-抑制性T细胞有显著性差异(P=0.000),但表现为R4显著低于另外三组。
　　 (3)杀伤性/抑制性T细胞比值:四组大鼠杀伤性/抑制性T细胞比值有显著性差异(P=0.000),但表现为R4显著高于另外三组。
　　 3.2 结肠
　　 总体而言,结肠杀伤性、抑制性T细胞及其比例的情况与外周血变化一致,但其组间差异不如外周血明显,具体:
　　 (1)杀伤性T细胞:四组大鼠CD8+CD28+杀伤性T细胞的组间差异具有显著性(P=0.047),其中R4显著高于R1组,其余组别的两两比较无统计学差异。
　　 (2)抑制性T细胞:四组大鼠CD8+CD28-抑制性T细胞的组间差异具有显著性(P=0.006),表现为R4显著低于R1及R2组。
　　 (3)杀伤性/抑制性T细胞比值:四组大鼠杀伤性/抑制性T细胞比值的组间差异具有显著性(P=0.000),表现为R4显著高于另外三组。
　　 4.细胞因子
　　 (1)IL-7:尽管四组血清IL-7不存在统计学差异(P=0.061),但组间比较显示R4组IL-7显著高于R1及R2组。
　　 (2)IL-12p40:组间大鼠IL-12p40存在统计学差异(P=0.014),组间比较显示R4组IL-12p40显著低于R1及R3组。
　　 (3)IL-13:在4个细胞因子当中,以IL-13的差异最为显著(P=0.000),但组间比较显示R4组IL-13显著高于R1及R2组。
　　 (4)IL-15:从整体看四组血清IL-15不存在组间显著性差异,但组间比较显示R4组IL-15显著低于R1及R2组。
　　 5.信号蛋白
　　 5.1 JAK3:Western blot及免疫组化均提示四组大鼠的JAK3蛋白均存在统计学差异(P=0.008,P=0.022),其中Western blot显示R4组JAK3蛋白显著高于另外三组；而免疫组化显示R4组仅明显高于R1组,与其他组比较无统计学差异。
　　 5.2 STAT6:Western blot及免疫组化均提示四组大鼠的STAT6蛋白均存在统计学差异(均为P=0.007),并且两种检测方法均显示R4组STAT6蛋白显著高于R1及R2组。
　　 6.转录因子
　　 6.1 NFATc2Western blot及免疫组化均提示四组大鼠的NFATc2蛋白存在统计学差异(P=0.036,P=0.034),并且两种方法均显示R4组NFATc2蛋白显著低于R1及R2组。
　　 6.2 GATA3Western blot及免疫组化均提示四组大鼠的GATA3蛋白存在统计学差异(P=0.005,P=0.007),其中Western blot显示的组间差异最为明显,且R4组明显低于R1及R2组。
　　 结论:
　　 1.不论对于人体抑或大鼠,CD8+CD28+杀伤性T细胞与CD8+CD28-抑制性T亚群及两者所构成的平衡,在脾虚型IBD发病机制均起到重要作用。对人体而言,脾虚证患者CD8+CD28+杀伤性T细胞明显降低,说明该细胞可能是脾虚证的重要客观指标；对大鼠而言,脾虚与CD8+CD28-抑制性T细胞明显相关,说明后者可能是实验性脾虚证的重要客观指标。
　　 2.从免疫学角度看,“CD8+CD28+杀伤性T细胞-IL-7-IL-13-JAK3-STAT6”五者的变化具有一致性,说明IL-7及IL-13可能是CD8+CD28+杀伤性T细胞所分泌的重要细胞因子,而JAK3及STAT6可能是该亚群重要的信号蛋白。此外,“CD8+CD28-抑制性T细胞-IL-12p40-IL-15-NFATc2-GATA3”五者的变化具有一致性,说明IL—12p40及IL-15可能是CD8+CD28-抑制性T细胞所分泌的重要细胞因子,而NFATc2及GATA3可能是该亚群重要的转录因子。
　　 3.对人类炎症性肠病而言,“CD8+CD28+杀伤性T细胞-IL-7-IL-13-JAK3-STAT6”五者在机体起到正面作用,是有利因素；对溃疡性结肠炎大鼠而言,“CD8+CD28-抑制性T细胞-IL-12p40-IL-15-NFATc2-GATA3”五者起到正面作用,是有利因素。以上免疫学现象可能与物种差异及溃疡性结肠炎大鼠的造模方法有关。