外源性硫化氢通过调控瘦素/瘦素受体-JAK/STAT通路抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一章 外源性硫化氢通过调控瘦素/瘦素受体通路抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。
　　中国糖尿病患者人数众多，目前已超过1亿人，糖尿病的主要危害在于其慢性并发症。高血糖是糖尿病的一个重要特征，是引起糖尿病几乎所有并发症（如大血管病变、微血管病变、神经病变等）最为直接的因素。高血糖可通过多种病理生理机制，如引起血管内皮细胞功能损伤等，导致糖尿病的多种并发症。
　　瘦素(leptin)是一种主要由脂肪细胞分泌的激素，通过瘦素受体(LEPR)发挥其生物活性。作为细胞因子，瘦素可以发挥多种生物效应，如调控炎症、繁殖和血管生成。瘦素/瘦素受体信号通路已在许多系统在生化和分子水平上被广泛研究。新近证据表明，瘦素可能是一个潜在的糖尿病血管病变治疗的新靶点。
　　硫化氢(H2S)是一种新型的气体信号分子。生理浓度的H2S对多种细胞有保护作用，由于具有抗氧化和对胞内信号通路的调节作用，近年来H2S在糖尿病血管病变的治疗作用吸引了学者们的研究兴趣。但是，外源性H2S能否通过调控瘦素/瘦素受体通路抑制高糖引起的血管内皮细胞损伤尚未明了。
　　目的：
　　1.探讨瘦素/瘦素受体通路是否介导高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤;
　　2.H2S能否通过调控瘦素/瘦素受体通路抑制高糖所致的HUVECs损伤。
　　方法：
　　1.应用40mmol/L葡萄糖作用于HUVECs24h建立高糖(HG，40mmol/Lglucose)损伤内皮细胞模型;
　　2.应用细胞计数检测试剂盒（CCK-8）检测细胞存活率;
　　3.Western Blot法测定瘦素和瘦素受体蛋白的表达水平;
　　4.Hoechst33258核染色荧光显微镜照相法检测HUVECs凋亡的形态学与数量改变;
　　5.双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧(ROS)水平;
　　6.罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照相法检测HUVECs线粒体膜电位(MMP)水平。
　　结果：
　　1.应用40mmol/L葡萄糖分别作用于HUVECs3～24h，3h开始明显上调瘦素的表达水平，于9h时瘦素表达水平最高(p＜0.01);
　　2.应用40mmol/L葡萄糖分别作用于HUVECs3～24h，3h开始明显上调瘦素受体的表达，于9h时瘦素受体表达水平达到峰值(p＜0.01);
　　3.应用400umol/L硫氢化钠(NaHS，为H2S的供体)预处理HUVECs30min能抑制高糖对瘦素表达水平的上调作用(p＜0.01);
　　4.应用400umol/L NaHS预处理HUVECs30min能抑制高糖对瘦素受体表达水平的上调作用(p＜0.01);
　　5.应用400umol/L NaHS预处理HUVECs30min可明显地减轻高糖诱导的HUVECs损伤，提高细胞存活率，减少细胞凋亡数量，减少胞内ROS堆积及MMP丢失(p＜0.01);
　　6.应用50ng/ml瘦素拮抗剂(LA)预处理HUVECs1h也能产生与NaHS相似的内皮细胞保护作用，使细胞存活率升高，细胞凋亡减少，胞内ROS堆积及MMP丢失减少(p＜0.01)。
　　结论：
　　1.瘦素/瘦素受体通路介导了高糖诱导的HUVECs损伤;
　　2.外源性H2S通过抑制瘦素/瘦素受体通路对抗高糖导致的HUVECs损伤。
　　第二章 硫化氢通过调控JAK/STAT通路抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤
　　在第一章中，已经证实H2S可通过抑制瘦素/瘦素受体通路对抗高糖诱导的HUVECs损伤。
　　Janus激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/Signal transducer andactivator of transcription，JAK/STAT)通路是最早被确认且最为重要的瘦素下游信号通路。瘦素与其受体结合后，改变其受体的构型，继而激活JAK蛋白(主要是JAK2)，被激活的JAK2再激活STAT（STAT3）通路。有研究指出，JAK/STAT通路参与瘦素诱导的心肌细胞肥大。还有人报道，高糖可通过激活JAK/STAT通路引起糖尿病肾病。但是，JAK/STAT通路是否介导高糖诱导的血管内皮细胞损伤尚未明了，相关研究较少，值得探讨。
　　目的：
　　1.探讨JAK/STAT通路是否介导高糖对HUVECs的损伤;
　　2.H2S能否通过调控JAK/STAT通路抑制高糖所致的HUVECs损伤。
　　方法：
　　1.应用40mmol/L葡萄糖作用于HUVECs24h建立高糖(HG，40mmol/Lglucose)损伤内皮细胞模型;
　　2.应用CCK-8检测细胞存活率;
　　3.Western Blot法测定磷酸化(p-)JAK2及p-STAT3蛋白的表达水平;
　　4.Hoechst33258核染色荧光显微镜照相法检测HUVECs凋亡的形态学与数量改变;
　　5.DCFH-DA染色荧光显微镜照相法检测胞内ROS水平;
　　6.Rh123染色荧光显微镜照相法检测HUVECs的MMP水平。
　　结果：
　　1.应用400umol/L NaHS预处理HUVECs30min能抑制高糖对p-JAK2表达的上调作用(p＜0.01);
　　2.应用400umol/L NaHS预处理HUVECs30min能抑制高糖对p-STAT3表达的上调作用(p＜0.01);
　　3.应用400umol/L NaHS预处理HUVECs30min可明显地减轻高糖诱导的HUVECs损伤，使细胞存活率升高，细胞凋亡数量减少，胞内活性氧(ROS)堆积及MMP丢失减少(p＜0.01）;
　　4.应用20μmol/L JAK/STAT通路抑制剂(AG490)预处理HUVECs30min也能起到与NaHS相似的内皮细胞保护作用，能提高细胞存活率，减少细胞凋亡，减少胞内ROS堆积及MMP丢失(p＜0.01）。
　　结论：
　　1.JAK/STAT通路介导了高糖诱导的HUVECs损伤;
　　2.H2S通过抑制JAK/STAT通路对抗高糖引起的HUVECs损伤。

目录

摘要

第一章 外源性硫化氢通过调控瘦素／瘦素受体通路抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 外源性硫化氢通过调控JAK／STAT通路抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 硫化氢与高糖诱导的血管内皮细胞损伤的关系及研究进展

攻读学位期间成果

附录

致谢

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