基于3D生物打印技术的微结构对组织工程表皮中干细胞行为的影响

摘要

皮肤是机体最大的器官，因烧、创伤导致的皮肤大面积损伤会造成机体局部畸形、皮肤功能失调，内环境稳态失衡甚至危及生命。因此，针对创伤后皮肤的修复再生是临床上亟待解决的问题。基于组织工程技术制成的皮肤替代物一度成为有效的修复途径，但这种皮肤替代物缺少汗腺、皮脂腺、毛囊等皮肤附属器，无法恢复正常皮肤的生理功能。目前，针对皮脂腺、毛囊的再生研究已相对成熟，但针对汗腺再生的研究进展缓慢，有功能的再生汗腺有助于提高机体对外环境的适应能力和恢复排汗功能。表皮干细胞作为皮肤发育的祖细胞，在分化为皮肤和皮肤附属器时有显著的优势，是汗腺再生研究中首选的干细胞类型。本团队在前期已证实3D微结构可诱导表皮干细胞分化为汗腺细胞，但不同构架的3D微结构在诱导效应上有差别，这为后续基于3D生物打印技术的汗腺再生研究在结构选择上造成了的困难。因此探索不同构架的3D微结构对表皮干细胞行为的影响并建立稳定且具良好诱导效应的3D微结构是后续研究的重要基础。
　　目的:基于3D生物打印技术探索不同构架的微结构对表皮干细胞行为学变化的影响并建立稳定且具良好诱导效应的3D微结构，为创伤后皮肤的修复与再生提供理论基础。
　　方法:1、表皮干细胞的提取:胚胎期12.5天的GFP-C57BL/6小鼠，剪取其背部皮肤后，采用已成熟的表皮干细胞培养方法进行培养。2、足趾部真皮基质匀浆:选择出生后0.5天的野生型C57BL/6小鼠，剪取其足趾部研磨成真皮基质匀浆(PD)。3、3D生物打印:选择3种不同直径的打印喷头（210μm、340μm和420μm）构建微结构。4、表皮干细胞行为学检测:荧光显微镜和活/死细胞染色技术用于展示3D微结构中表皮干细胞的增殖能力和细胞活性，免疫荧光染色技术用于检测3D微结构中表皮干细胞分化为汗腺细胞的能力。5、统计学分析:采用方差分析和样本t检验等方法进行统计学分析。
　　结果:1、三种不同构架的3D微结构均可促进小鼠表皮干细胞的有效增殖。2、在各个观察时间点上，210μm组3D微结构中的表皮干细胞活性最低，420μm组的细胞活性最高，细胞活性与剪切应力呈反比。3、三种不同构架的3D微结构均可诱导小鼠表皮干细胞分化为汗腺细胞。4、340μm组3D微结构中表皮干细胞可聚集形成类腺样球形结构。
　　结论:本次研究构建的340μm组3D微结构具有最佳的诱导效应。这为后续基于3D生物打印技术的汗腺再生研究以及进一步构建具有生物相容性的组织工程表皮模型奠定了基础。

目录

摘要

前言

研究现况与成果

研究目的与方法

第一章 实验仪器和材料

1．1 主要实验试剂

1．2 主要实验仪器

1．3 实验所用溶液的配制

第二章 基于3D生物打印技术构建含细胞微结构仿生模型

2．1 材料与方法

2．1．1 小鼠表皮干细胞的分离与培养

2．1．2 野生型C57BL／6小鼠足趾部真皮基质匀浆(PD)的提取

2．1．3 3D生物打印墨水的制备与保存

2．1．4 构建三种不同构架的3D微结构仿生模型

2．1．5 流变学参数检测

2．1．6 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 3D微结构仿生模型的特征

2．2．2 微结构的机械参数分析

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 3D微结构仿生模型中小鼠表皮干细胞活性的变化

3．1 材料与方法

3．1．1 活／死细胞活性染色技术的应用

3．1．2 定量计数各个不同观察时间点的细胞活性

3．1．3 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 不同观察时间点上各组细胞活性的变化

3．2．2 细胞活性与剪切应力的关系

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 3D微结构仿生模型中细胞聚集成团与细胞增殖

4．1 材料与方法

4．1．1 荧光显微镜用于连续性观察

4．1．2 病理冰冻切片与苏木素-伊红染色(HE染色)

4．1．3 统计学分析

4．2 结果

4．2．1 不同观察时间点上细胞聚集成团的情况

4．2．2 光镜观察结果与HE染色结果的一致性和差异性

4．2．3 细胞聚集成团和细胞增殖与剪切应力的关系

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 3D微结构仿生模型中小鼠表皮干细胞定向分化为汗腺细胞

5．2．1 小鼠表皮干细胞在3D微结构中的起始分化时间点

5．2．2 分化进程与剪切应力的关系

5．3 讨论

5．4 小结

结论

参考文献

附录

综述 3D生物打印技术的进展

致谢

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