绿脓杆菌中新型群体感应信号分子IQS的生物合成途径的研究

摘要

群体感应（Quorum sensing，QS）是微生物中广泛保守存在的一种细胞与细胞间的通信机制，协调细菌各种群体活动，参与调控细菌的致病性。研究群体感应机制对控制和预防细菌感染至关重要。绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），属假单胞菌属（Pseudomonas），采用由las、pqs及rhl调控系统组成的群体感应网络协调其毒力基因表达。其中las系统位于级联反应的顶端。不少临床分离株均发现中央las系统功能突变受损，张炼辉带领的团队于2013年首次发现绿脓杆菌中一种取代las的机制，并分离鉴定到一种新群体感应信号IQS，上连中央las系统和磷酸胁迫应激反应机制，下接pqs及rhl系统。阻断IQS合成导致pqs及rhl系统的群体感应并显著降低菌株毒力。IQS产生受las严格控制但同时也被磷酸贫乏状况激活，磷酸贫乏是细菌感染过程中的常见胁迫信号。低磷酸盐离子浓度条件下的绿脓杆菌，利用IQS系统，在低磷响应的转录激活因子PhoB的调控下，越过las系统，激活rhl以及pqs系统，表现生物毒性。
　　本课题使用分子微生物学、基因组学、生物化学和分析化学的研究手段作为主要研究方法来研究IQS的生物合成途径。根据文献报道，四个在同一操纵子的基因（ambB、ambC、ambD和ambE）参与了IQS的生物合成。我们通过高效液相色谱HPLC和液质联用LC-MS的方法分析检测△amb突变体菌株,导入amb合成基因簇的大肠杆菌ambBCDE-DH5a的菌株和野生型PAO1菌株的中IQS相关信号的变化情况，发现amb基因突变不会导致IQS产量变化，且异源表达菌株未检测到IQS的峰（m/z205），而是检测到抗代谢物AMB（m/z131.06）的峰。结合生物信息学提供的NRPS合成基因预测，发现一组pch功能基因簇。早期的研究发现，pch基因簇参与了铁载体Pyochelin的生物合成。通过构建pchA、B、C、D、E、F和G的突变体，分别检测了突变体中IQS的产生情况。发现pch的突变体中，均检测不到IQS的产生；而在pchE(△pchE)互补体能恢复IQS产生。初步证明amb不是直接参与IQS的生物合成，而pch基因则参与合成IQS。IQS分子的的合成底物为1分子水杨酸（Sal）和1分子半胱氨酸（Cys），我们进行底物添加实验。向△pchA,△pchD,△pchE培养液中添加底物水杨酸，结合高效液相色谱分析明确相关重要基因的功能，初步阐明了IQS生物合成途径，证实IQS的前体为铁载体Pyochelin生物合成途径的中间产物。
　　为阐明绿脓杆菌群体感应机理和致病调控机制奠定了基础。

目录

声明

1 前言

1.1 绿脓杆菌概况

1.2 微生物群体感应及研究概况

1.3 绿脓杆菌已知群体感应系统

1.4 绿脓杆菌新集成型群体感应系统

1.5非核糖体肽合成酶（NRPS）的研究进展

1.6 本课题研究目的与意义

2材料与方法

2.1菌株、质粒与引物

2.2培养基与缓冲液

2.3菌株培养条件与抗生素使用浓度

2.4主要试剂与仪器

2.5 生物信息学分析

2.6 关键基因的敲除及突变株鉴定

2.7 敲除突变株的代谢产物分析

2.8 生物合成中关键基因的功能研究

2.9底物氨基酸外源添加实验

3结果与分析

3.1 amb基因簇的生物信息学分析

3.2 ambB基因的敲除及突变株鉴定

3.3 ambB敲除突变株的代谢产物分析

3.4 IQS生物合成中关键基因的功能研究

3.5底物氨基酸外源添加实验确定的IQS生物合成途径

4结论与讨论

4.1 结论

4.2讨论

5创新点

致谢

参考文献