肠道共生菌CF-BD增强桔小实蝇敌百虫抗药性的作用及其机制

摘要

桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）是热带、亚热带地区重大的果蔬害虫。目前化学农药是防治桔小实蝇的主要方法，其中有机磷杀虫剂敌百虫因其高效且对人类低毒而被广泛应用于该虫的防治。但由于敌百虫的泛滥使用，导致桔小实蝇对敌百虫的抗药性不断增强。桔小实蝇肠道中存在大量的共生菌，已有研究发现敌百虫抗性品系桔小实蝇肠道中的柠檬酸杆菌明显增加，经分离鉴定后确定这种共生细菌为弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii-BD（CF-BD）。为了明确肠道共生菌CF-BD与桔小实蝇敌百虫抗药性的关系，本文研究了 CF-BD对桔小实蝇敌百虫抗药性的影响，探清了CF-BD提高桔小实蝇对敌百虫抗药性的机制，阐明了该菌的传播方式，不仅为桔小实蝇对杀虫剂抗性产生的机制研究提供了新思路，也对未来桔小实蝇防治策略的制定提供了新的理论支持。主要研究结果如下：
　　1、CF-BD对桔小实蝇敌百虫抗药性的影响
　　为了明确CF-BD与桔小实蝇敌百虫抗药性是否有关，分别对喂食CF-BD后的敏感品系桔小实蝇、喂食抗生素以去除CF-BD的抗性品系桔小实蝇进行了敌百虫毒力测定，结果发现喂食CF-BD的敏感品系桔小实蝇肠道中CF-BD的菌落数显著高于喂食清水的对照组（p<0.01），且喂食CF-BD的桔小实蝇对敌百虫抗药性显著高于对照组（p=0.011；喂食CF-BD的敏感品系LC50=2.35 mg/L，正常敏感品系LC50=1.28 mg/L）。而经链霉素处理的抗性品系桔小实蝇肠道样品中CF-BD菌落比喂食无菌水的抗性品系桔小实蝇明显减少（p<0.01），且对敌百虫更敏感（p<0.0001；喂食链霉素的抗性品系LC50=89.78 mg/L，正常抗性品系LC50=133.31 mg/L）。这一结果证实了CF-BD的增加能够提高桔小实蝇对敌百虫的抗药性。荧光原位杂交试验发现，CF-BD被定位于桔小实蝇肠道的中肠和后肠，并大量存在于桔小实蝇雌成虫的直肠垫中。
　　2、CF-BD降解敌百虫机制研究
　　为了探清CF-BD对敌百虫的降解途径，利用GC-MS分析鉴定了CF-BD降解敌百虫后的产物，结果显示，无CF-BD的敌百虫培养基滤液可滤出更多的敌百虫（p=0.014）。而加入CF-BD的敌百虫被降解为水合氯醛和亚磷酸二甲酯，两个分解产物的毒力较敌百虫大大降低。通过对CF-BD的基因组测序及分析，注释发现了55个磷酸酶基因，且其中5个（基因号：0086，1012，1747，2752，4498）为有机磷水解酶（organophosphate-hydrolyzing，OPH）相似基因。对这5个磷酸酶基因在不同浓度敌百虫中的相对表达量进行了实时荧光定量PCR检测，结果表明0086、1012、1747和4498基因在有敌百虫存在时表达量显著提高，进一步揭示了CF-BD对敌百虫的降解机制。
　　3、CF-BD在桔小实蝇田间种群中的分布及对寄主适合度的影响
　　为了解CF-BD在桔小实蝇田间种群中的分布情况，采集包括广州市内8个地点及四川省、海南省、广西省、河南省、福建省等在内的13个地点的野外种群桔小实蝇并进行了 CF-BD的检测及定量分析。结果表明，田间种群桔小实蝇个体中均能检测出CF-BD。接下来对广州市不同地点采集的桔小实蝇成虫进行了毒力测定，发现大部分田间桔小实蝇都具有敌百虫抗药性，与桔小实蝇实验种群敌百虫中抗品系（LC50=70 mg/mL）相比，抗性水平约为中等偏低。为进一步探究CF-BD的功能，本文研究了 CF-BD对桔小实蝇适合度的影响，测定了桔小实蝇各发育阶段的体重干重、后代性比、成虫寿命和产卵量，结果显示，CF-BD对桔小实蝇幼虫和蛹的生长发育影响很大，体内含有CF-BD的试虫干重显著高于整个世代都缺少CF-BD的桔小实蝇。同时，CF-BD对桔小实蝇雌成虫的生殖力影响也很大，链霉素处理后再添加CF-BD也会导致成虫产卵量下降，而整个世代都缺少CF-BD的成虫几乎不产卵。
　　4、CF-BD在桔小实蝇种群内的传播途径
　　为了明确CF-BD在桔小实蝇种群内的传播途径，通过平板检测、巢式PCR进行了一系列混合饲养及交配试验。结果表明 CF-BD是通过卵表携带进行垂直传播， CF-BD在幼虫或成虫间可以通过食物进行水平传播，而不能通过交配进行水平传播。桔小实蝇产卵后的番石榴细菌群落结构研究结果表明，柠檬酸杆菌在番石榴内能持续增殖且稳定存在。

目录

声明

1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的及意义

1.3 技术路线

2 CF-BD对桔小实蝇敌百虫抗药性的影响及在肠道中的定位

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

3 CF-BD全基因组测序及降解敌百虫机制研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.3 小结

4 CF-BD在桔小实蝇田间种群中的分布及对寄主适合度的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 小结

5 CF-BD在桔小实蝇种群中的传播途径

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

6 结论与讨论

6.1 结论

6.2 讨论

6.3 本文研究的创新点

6.4 有待深入研究的内容

致谢

参考文献

附录A 基因序列信息

附录B