松墨天牛超气门蛋白的克隆与功能研究

摘要

松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）属于鞘翅目（Coleoptera），天牛科（Cerambycidae）是危害马尾松（Pinus massoniana）等松材的重大森林害虫，是松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的主要传播媒介。近3年来，松墨天牛分子生物学领域的研究从个别基因的克隆发展到转录组研究，为高通量研究基因奠定了基础；从单纯的生物信息学分析发展到结合生理学、毒理学及化学生态学等综合研究，充分展现了分子生物学的研究优势。
　　超气门蛋白(ultraspiracle, USP)处于昆虫发育、变态及繁殖等过程级联调控的开始位置，研究不同目昆虫USP的结构及功能特点，深入地了解其作用方式及开展应用研究，无论对益虫生长发育的调控亦或是对害虫的防治都有重要的理论和实用价值。本文研究松墨天牛超气门蛋白cDNA的序列特征、功能等，对于开发环境友好型新药剂和基因调控开关等方面具有重要指导作用。
　　本研究采用RACE方法克隆得到松墨天牛USP基因全场序列，应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）方法对其功能进行了研究，同时进行了生物信息学分析。主要结果如下：
　　（1）松墨天牛超气门蛋白基因的克隆：通过RACE方法扩增得到松墨天牛超气门蛋白基因3′端和5′端，进而通过与从松墨天牛cDNA文库中筛选出的超气门蛋白基因序列片段拼接得到一条全长为1583bp的松墨天牛超气门蛋白基因序列，其中包含186bp的5′端非编码区、241bp的3′端非编码区，以及12bp的Poly A尾巴和从第1547位至1552位的一个特征性序列，即加尾信号AATAAA。该序列的开放阅读框ORF为1155bp，编码384个氨基酸，预测其分子式为C1875H3028N536O566S23，相对分子量42.87kDa，理论等电点（Theoretical pI）为8.49；通过NCBI在线工具BLAST氨基酸序列与7种昆虫的USP相似度极高，其中与马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）的相似性最高，为90%；构建的系统进化树显示，松墨天牛与马铃薯甲虫聚成一支，与鞘翅目昆虫遗传距离较近，而与其他非鞘翅目昆虫遗传距离较远。
　　（2）松墨天牛超气门蛋白理化性质分析：对所得松墨天牛USP基因编码蛋白进行了氨基酸组成、疏水性、跨膜区、糖基化修饰预测、磷酸化修饰预测、信号肽、二级结构、三级结构、亚细胞定位、保守结构域的生物信息学分析。结果显示：该蛋白含有构成生物体蛋白质的20种氨基酸，其中亮氨酸含量最多、其次为丝氨酸；平均亲水系数：-0.364，为两性氨基酸；MaUSP无跨膜区，其为膜外蛋白的概率为100%；丝氨酸(Ser)磷酸化位点20个，苏氨酸(Thr)磷酸化位点14个，酪氨酸(Tyr)磷酸化位点4个，共计38个磷酸化位点；在256和379氨基酸位点存在N-糖基化修饰；该蛋白主要由α螺旋与无规则卷曲组成；蛋白亚细胞定位细胞核的可能性最大（60.9%）；预测的MaUSP氨基酸保守结构域有两个，其中DNA结合域（DBD）由第66位至第142位共77个氨基酸组成，配体结合域（LBD）由第162位至第363位共202个氨基酸组成。
　　（3）松墨天牛USP基因DBD、LBD域RNA干扰实验：松墨天牛4龄、5龄幼虫在注射MaUSP-DBD、MaUSP-LBD的dsRNA后，分别对试虫检测MaUSP-DBD、MaUSP-LBD、MaEcR的相对表达量，结果均下调表达，总体上4龄幼虫的RNA干扰效率大于5龄幼虫的干扰效率（P<0.05），致死表型比率也高于5龄幼虫。经过dsRNA处理的幼虫产生了严重的不正常生长发育以及表型缺陷的现象，难以完成幼虫-幼虫的蜕皮过程，幼虫-蛹的变态过程，说明USP基因对于松墨天牛的幼虫-幼虫，幼虫-蛹的变态的过程起到关键作用。推测当USP与EcR处于不同滴度水平时使虫体出现异常表型；二者处于相当滴度水平时，能保持虫体的正常形态；USP先于EcR转录并行使功能，USP-DBD域先于USP-LBD域行使功能并激活USP-LBD域，进而调节EcR的滴度水平，EcR的滴度水平变化可能通过刺激USP-DBD以调节USP的滴度水平，从而维持两者处于相当的滴度水平。

目录

声明

1 前言

1.1 松墨天牛分子生物学研究进展

1.2 昆虫蜕皮变态

1.3 超气门蛋白简介

1.4 USP的研究前景

1.5 RNAi技术与应用

1.6 研究内容和技术路线

1.7 研究意义

2.1 供试天牛

2.2 主要试剂及仪器设备

2.3 松墨天牛总RNA提取

2.4 引物合成

2.5 cDNA 3′ 末端扩增

2.6 目的基因克隆及测序

2.7 cDNA 5′ 末端扩增

2.8 目的基因克隆及测序

2.9 RNA干扰

2.10 生物信息学分析方法

3 结果与分析

3.1 松墨天牛4龄幼虫总RNA的提取

3.2 MaUSP基因序列拼接和分析

3.3 USP基因序列相似性比对

3.4 USP构建的系统发育树

3.5 推测出的MaUSP 蛋白的相关分析

3.6 MaUSP基因的功能

4 讨论与结论

4.1 松墨天牛USP序列分析

4.2 RNAi 研究USP 基因的功能

4.3 结论

致谢

参考文献

附录