酪蛋白酶解物中酪蛋白磷酸肽定性、定量检测方法及其应用研究

摘要

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，简称CPP）的结构特性，决定了其种类的多样性。不同的公司使用的酶以及酶解条件不同，最终获得的CPP序列会存在一定差别，目前尚无统一的定性定量方法评价及检测CPP。为了解决这个问题，对酪蛋白进行了酶解，对其酶解产物进行了定性分析，并分离出持钙活性肽，对其中的主要成分进行了分离及序列鉴定，筛选了含CPP样品的前处理方式，同时建立了CPP的高效液相色谱检测方法，并进行了应用。主要研究内容及结果如下：
　　（1）从酪蛋白酶解物中筛选出了CPP，分离出了5个单体组分，并鉴定了活性单体的结构序列，其中磷酸丝氨酸个数最多的单体序列为：RELEELNVPGEIVESLSS SEES ITR。
　　（2）从不同样品前处理方式中选择了相对合适的液态奶、奶粉及钙片样品的前处理方式：牛奶采用三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，简称TCA）法结合热变性法、酸奶采用先稀释调节pH再用TCA法、奶粉采用等电点法、钙片采用溶解超声提取法，检测结果显示分析效果较好。
　　（3）优选了色谱柱、流动相、柱温及流速等HPLC分析条件，筛选出的分析CPP条件为：色谱柱采用月旭的C18柱、流动相为乙腈添加1‰三氟乙酸（Trifluoroacetic Ac id，简称TFA）和水添加1‰TFA、柱温35℃、二元高压梯度洗脱模式、总流速0.8 mL/min、紫外检测波长215 nm。
　　（4）建立了奶粉中CPP的HPLC定量检测方法，其梯度洗脱条件为：10%～20%乙腈（1‰TFA）洗脱15 min，20%～26%乙腈（1‰TFA）洗脱30 min，进样量20μL。该方法的检测限为15.34 mg/k g，定量限为51.14 mg/k g。在此条件下，CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果，检测到奶粉样品中CPP的加标回收率在97.59%～100.00%之间，接近真实添加量。同时测定了不同厂家的奶粉样品，检测结果与厂家标称含量接近，该方法适用性良好。
　　（5）建立了牛奶中CPP的HPLC定量检测方法，其梯度洗脱条件为：5%～35%乙腈（1‰TFA）洗脱45 min，进样量20μL。该方法的检测限为6.00 mg/k g，定量限为20.00 mg/k g。在此条件下，CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果，检测到牛奶样品中CPP的加标回收率在89.36%～94.94%之间，接近真实添加量。
　　（6）建立了酸奶中CPP的HPLC定量检测方法，其梯度洗脱条件为：10%～20%乙腈（1‰TFA）洗脱15 min，20%～26%乙腈（1‰TFA）洗脱30 min，进样量20μL。该方法的检测限为3.07 mg/k g，定量限为10.23 mg/k g。在此条件下，CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果，检测到酸奶样品中CPP的加标回收率在97.73%～102.28%之间，接近真实添加量。
　　（7）建立了钙片中CPP的HPLC定量检测方法，其梯度洗脱条件为：5%～35%乙腈（1‰TFA）洗脱45 min，进样量20μL。该方法的检测限为13.62 mg/k g，定量限为45.40 mg/k g。在此条件下，CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果，检测到钙片样品中CPP的加标回收率在95.51%～102.26%之间，接近真实添加量。同时测定了不同钙片样品，检测结果与厂家标称含量接近，该方法适用性良好。建立了CPP快速钙盐直观评价法演示试验，结合原子吸收光谱仪检测钙含量，确认了快速钙盐直观评价法演示试验的可靠性，并依据结果可知，添加了CPP的钙片，钙离子保持溶解的时间更长。

目录

声明

论文所用缩写及中英文对照表

1前言

1. 1乳源活性肽研究概况

1. 2 C PP研究及应用概况

1. 3 C PP定性方法

1. 4 C PP的分离纯化

1. 5 C PP定量方法

1. 6研究目的和意义

1. 7研究内容

1. 8技术路线

2. 1实验材料

2. 2实验试剂

2. 3主要仪器与设备

2. 4实验方法

3结果与分析

3. 1酪蛋白酶解物中CPP的定性分析

3. 2 C PP活性单体的制备液相条件优化及结构鉴定

3. 3样品前处理方式的选择

3. 4 C PP液相分析条件研究

3. 5奶粉中CPP检测

3. 6牛奶中CPP检测

3. 7酸奶中CPP检测

3. 8钙片中CPP检测及快速钙盐直观评价法

4讨论与结论

4. 1 C PP定性定量方法

4. 2 C PP快速钙盐直观评价法的建立

4. 3样品前处理及检测

4. 4结论

4. 5本文创新之处

4. 6存在的问题与展望

致谢

参考文献

附录