胆固醇-半乳糖苷配体修饰紫杉醇脂质体的制备及其抑制HepG2肿瘤细胞的研究

摘要

目的:
　　半乳糖受体是一种广泛分布在哺乳动物肝实质细胞的受体，又被称为去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)，能够应用于构建肝细胞特异性靶向脂质体。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是红豆杉中提取的四环二萜类化合物，是一种广谱抗癌药物;临床研究表明对肝癌细胞的杀伤能力可与氟尿嘧啶相当而副作用较小。探究紫杉醇纳米制剂对肝癌的治疗是目前紫杉醇研究开发的新目标。本首先酶促合成胆固醇-半乳糖苷，将其作为配体制备胆固醇-半乳糖苷修饰紫杉醇配体脂质体，利用半乳糖配体的肝靶向性，使修饰物在肝脏富集，更有效地发挥紫杉醇抗肝癌的作用;同时，考察该配体脂质体的处方、制备工艺、基本理化性质和稳定性，并且以紫杉醇注射液和普通紫杉醇脂质体为参比制剂，对该配体脂质体的体内药物动力学、组织分布、体外的抑制肿瘤细胞活性进行深入探讨，为紫杉醇开发成抗肝癌新型靶向制剂提供理论支撑。
　　方法:
　　1.胆固醇-半乳糖苷的酶促合成、分离纯化、结构表征及稳定性考察
　　以吡啶∶丙酮(2∶1，v/v)混合溶剂作为溶媒，利用Novozym435固定化脂肪酶的催化，在一定温度下，乳糖醇与胆固醇癸二酸二乙烯单酯酯化生成胆固醇-半乳糖苷配体。采用单因素考察分析各因素对该酶促酯化反应的影响规律，Box-Behnken效应面法设计进一步优化工艺参数。通过层析柱分离纯化产物;建立胆固醇-半乳糖苷含量的HPLC分析方法;利用TLC、MS、IR、NMR等技术分析鉴定产物结构特征。通过影响因素、加速试验考察该配体的稳定性。
　　2.胆固醇-半乳糖苷修饰的紫杉醇配体脂质体的制备及理化性质研究
　　在脂质材料中加入适当比例(w％)的胆固醇-半乳糖苷，采用薄膜分散法，水化孵育、超声、微孔滤膜过滤后，制备了紫杉醇配体脂质体;通过单因素考察和正交设计法，优选最佳处方，获得质优、稳定的脂质体;考察紫杉醇配体脂质体的外观、粒径、zeta电位、包封率。
　　3.紫杉醇配体脂质体在SD大鼠体内的药物动力学及KM小鼠组织分布学研究
　　以紫杉醇(Paclitaxel，PTX)为目标药物，制备PTX-i普通注射液、PTX-L普通脂质体和Gal-PTX-L配体脂质体三种制剂;SD大鼠、KM小鼠作为动物模型，通过尾静脉注射方式给药，分别考察这三种紫杉醇制剂在机体内的药物动力学参数，以及在心、肝、脾、肺、肾等组织的分布;利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取法分离出血浆中的PTX，以多烯紫杉醇(Docetaxel，DOC)为内标物计算PTX血药浓度;DAS2.1软件分析药物动力学数据。
　　4.紫杉醇配体脂质体的体外抗HepG2细胞活性研究
　　在体外抗肿瘤试验中，大量培养人肝癌细胞HepG2细胞株，接种适量HepG2细胞于96孔培养板，实验分四组:阴性对照组、PTX注射液组、PTX-L组、Gal-PTX-L组，以给药24-48-72h后，通过CCK(四唑单钠盐类)法和LDH(乳酸脱氢酶)法分别测定细胞存活率、三种含紫杉醇的药物的IC50和细胞释放的LDH活性(IU/L)，进而综合评价该Gal-PTX-L制剂的抗肿瘤疗效优势。
　　结果:
　　1.胆固醇-半乳糖苷的酶促合成、分离纯化、结构表征及稳定性
　　利用酶法成功制备了胆固醇-半乳糖苷配体，考察了酶的种类、加酶量、反应介质、反应温度、底物摩尔比、反应时间等单因素对酶催化的影响，建立了Box-Behnken效应面模型，获得最优反应条件:乳糖醇(Lactitol，LA)与胆固醇癸二酸单烯酯(Cholesterylhemi-vinyl sebacate，CHS-DD)摩尔比1∶3.7，Novozym43522.8mg，吡啶∶丙酮(2∶1，V/V)2.1mL，温度55℃，反应时间31.2h，该条件下产率可达94％以上。通过简单的柱层析流程，分离纯化胆固醇-半乳糖苷配体分子。经过TLC、MS、IR、NMR等技术，确证了产物的结构特征。根据影响因素试验的结果，该配体的包装应密封，放置在干燥、阴凉、避光处。
　　2.胆固醇-半乳糖苷修饰的紫杉醇配体脂质体的制备及理化性质研究
　　以紫杉醇(PTX)为目标药物，制得PTX普通脂质体、PTX半乳糖基化脂质体。建立了脂质体中包合的PTX的HPLC含量测定法，通过线性、专属性、精密度、回收率、重复性和稳定性考察，证明该方法适用、可靠。选取药脂比、磷脂与胆固醇比和胆固醇-半乳糖苷用量(w％)为考察对象，包封率(％)为评价指标，设计正交试验优化脂质体制备工艺参数，获得最佳工艺条件为:磷脂与药物的质量之比为4∶1，磷脂与胆固醇的质量之比为5∶1，胆固醇-半乳糖苷用量(w％)为8％。在最优工艺下，制备三份样品，显示包封率86％以上，粒径保持在160nm左右。
　　3.紫杉醇配体脂质体在SD大鼠体内的药物动力学及KM小鼠组织分布学研究
　　首先建立了血浆中PTX浓度的LC-MS/MS测定方法，通过方法学考察证明了该方法适用、可行;考察了血液样品的萃取药物方法，证实甲基叔丁基醚萃取效果更佳，符合分析的要求;三种制剂经大鼠尾静脉给药（5mg/kg）后，半衰期T1/2z(h)分别是4.26±0.72(PTX-i)，2.83±1.28(PTX-L)，3.32±2.05(Gal-PTX-L);表观分布容积Vz(L/kg)分别是9.44±2.28(PTX-i)，3.89±1.03(PTX-L)，16.11±6.23(Gal-PTX-L);清除率CLz(L/h/kg)分别为1.46±0.17(PTX-i)，1.12±0.35(PTX-L)，4.06±1.55(Gal-PTX-L)。另外，经小鼠尾静脉给药后，紫杉醇普通脂质体、紫杉醇配体脂质体肝靶向参数Re分别是0.105和4.103;Te(％)为3.083和56.112;RTe为0.117和2.105;Ce为0.109和3.298。
　　4.紫杉醇配体脂质体的体外抗HepG2细胞活性研究
　　在0.1μg/mL剂量下，PTX-i组、PTX-L组、Gal-PTX-L组的24h细胞存活率分别为:50.08％，26.25％和11.38％;48h细胞存活率各是:45.84％，32.25％和19.17％;72h细胞存活率为:43.03％，28.45％和24.85％。另外，三组药物的IC50分别是0.438μg/mL，0.121μg/mL和0.037μg/mL。药物干预后三组药物的培养液中24hLDH的活性分别是20.14IU/L，27.67IU/L和39.37IU/L;48hLDH的活性分别是34.60IU/L，51.74IU/L和65.11IU/L;72hLDH的活性分别为48.98IU/L，65.20IU/L和80.91IU/L。
　　结论:
　　综上所述，胆固醇-半乳糖苷的合成及其紫杉醇配体脂质体的研究，提供了一种新颖、高效和稳定的将半乳糖基化脂质体药物运送至HepG2靶细胞并发挥抗肿瘤活性的途径。通过药物动力学和组织分布研究，确认了紫杉醇配体脂质体比普通制剂具有更好的肝靶向性，更容易在肝脏蓄积;在体外抗肝肿瘤细胞研究中，表明紫杉醇配体脂质体能够发挥良好抑制肝肿瘤细胞生长的疗效，差异具有统计学意义(P＜0.01)。因此，我们有理由相信紫杉醇配体脂质体在肝病治疗中拥有广阔的应用前景。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

一 配体靶向脂质体

1 概述

2 配体靶向脂质体的定义

3 配体靶向脂质体的优势

4 配体靶向脂质体的研究现状

二 酶促合成的相关研究

1 概述

2 酯交换反应的研究概况

3 脂肪酶的种类与选择

4 影响合成反应的因素

5 效应面优化法

三 紫杉醇的研究进展

1 概述

2 主要来源

3 作用机制及应用

4 细胞活力测定方法

四 制剂的非临床药物动力学研究

1 概述

2 基本研究原则

3 药物分析测定方法

五 肝癌动物模型的研究

第二章 实验内容

一 胆固醇-半乳糖苷的合成研究

1 酰基供体癸二酸二乙烯酯的合成

2 胆固醇癸二乙烯单酯的合成

3 胆固醇-半乳糖苷的合成优化及稳定性研究

二 胆固醇-半乳糖苷修饰的紫杉醇配体脂质体的制备及理化性质研究

1 实验材料

2 实验方法与结果

3 小结

三 紫杉醇配体脂质体的药物动力学及组织分布研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结部分

四 体外HepG2细胞毒性试验

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结部分

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢