北冰洋高纬度深海表层沉积物和红海高盐环境样品中石油烃降解菌的种群结构分析

摘要

本文主要研究了两种极端海洋环境中石油烃降解菌的种群结构。第一部分主要是研究北冰洋高纬度深海表层沉积物中PAHs降解菌的种群结构，并对其中一株降解菌的生理生化特性及其PAHs降解特性进行了初步研究;第二部分主要是研究采自红海的高盐海水、卤水和沉积物样品中石油烃降解菌的种群组成。
　　 第一部分
　　 随着全球气候变暖和人类活动的日益频繁，输入到北冰洋的持久性有机污染物日益增多。为了研究北冰洋高纬度深海表层沉积物中多环芳烃（PAHs）降解菌的种群结构，并获得新的降解菌资源，本文在GC-MS分析沉积物中PAHs种类和含量的基础上，以萘、菲和芘的混合物为唯一碳源和能源，对采自北冰洋高纬度4个典型区域（楚科齐海台，加拿大海盆，阿尔法海脊和马卡罗夫海盆）4个站位的12份深海表层沉积物，分别在4℃，15℃和25℃进行了富集，共获得了36个PAHs降解菌群。随后，以细菌16SrRNA基因Ⅴ3区为靶标，利用PCR-DGGE技术分析了不同温度下降解菌群的种群结构，同时利用Illumina高通量测序技术（靶标:16SrRNAⅤ6区）对25℃富集菌群的种群结构进行了对比分析。此外，通过GC-MS测定了25℃富集菌群对菲和芘的降解率，还通过平板分离鉴定可培养菌株，并验证其降解能力。
　　 GC-MS测定结果表明，12个表层沉积物中PAHs总量介于96.08-276.29ng/gdw，且菲和芴是含量最多的两种PAHs。PCR-DGGE和Illumina高通量测序结果均表明，在12个25℃富集菌群中，来自马卡罗夫海盆BN12站位的3个降解菌群的种群结构与来自其它3个站位的9个菌群有明显差异。其中，Cycloclasticus，Marinobacter和Pseudomonas是BN12站位三个菌群中的优势降解菌;而其它站位的优势菌则归属于Pseudoalteromonas，Halomonas，Pseudomonas及Marinobacter属。在45天内，BN12站位三个菌群对菲和芘的降解率分别介于63.8％-97.4％和45.8％-80.2％，明显高于其它9个菌群15.2-33.9％和4.8％-30.6％的降解率。4℃和15℃富集菌群的PCR-DGGE分析结果表明，Cycloclasticus在BN12站位4℃和15℃的降解菌群中均是最优势的降解菌，而Thalassolituus仅为4℃富集菌群中的优势菌。
　　 利用平板纯培养的方法，分别从4℃，15℃和25℃降解菌群中分离获得40，41和64株可培养细菌。Pseudoalteromonas和Pseudomonas在三个不同温度的富集菌群中均是优势的可培养菌;Shewanella仅是4℃富集菌群中的可培养优势菌，而Halomonas和Marinobacter在15℃和25℃富集菌群中均为可培养优势菌。
　　 随后，我们对分离自BN12M菌群(BN12站位，25℃富集)的一株降解菌D104的生理生化特性及其PAHs的降解特性进行了初步的研究。克隆测序结果表明，菌株D104和模式菌株MarinomonasushuaiensisU1(T)在16SrRNA基因序列上的相似性为仅97.72％，是一株潜在的新种;单菌降解实验结果表明，它可以在4℃、15℃、25℃下较好地降解萘、菲、芘三者的混合物，同时也可以在25℃条件下，降解芴、蒽、芘及萘和芘的混合物。目前，菌株D104是Marinomonas属中第一株分离自北冰洋，并被证明具有多种PAHs降解能力的菌株。
　　 第二部分
　　 为了研究高盐环境中石油烃降解菌的种群结构，本文以石油烃为唯一碳源和能源对采自红海7个站位的10个样品进行富集，16SrRNA基因Ⅴ3区的PCR-DGGE结果表明，10个降解菌群的结构均较简单，优势菌主要是γ-proteobacteria的Alcanivorax，Marinobacter，Idiomarina和Salinisphaera。通过重量法测定各个菌群对石油的降解率结果表明，除了Seep4菌群的降解率为9.43％外，其它菌群介于36.85-85.87％。
　　 通过含石油的M2平板和普通M2平板的分离培养，共从上述10个菌群中获得22株细菌和9株酵母菌，系统进化分析表明，22株细菌主要是γ-proteobacteria的Alcanivorax、Idiomarina和Actinobacteria门中的Brevibacterium属;9株酵母菌全部归属于毕赤酵母属。各单菌对石油烃的降解实验表明，酵母菌的油降解率在37.8-57.24％之间，而细菌中只有两株Alcanivorax菌的降解效果较好，它们均来自盐度相对较低的TS06站位（盐度4.3％），其降解率分别是44.66％和53.94％。
　　 综上所述，本文首次对北冰洋高纬度深海表层沉积物与红海高盐海洋环境样品中的石油烃降解菌的种群结构进行研究，并对其中石油烃降解菌的降解特性进行了初步的研究。研究结果将有助于揭示上述两种海洋极端环境中石油烃降解菌在原位的降解机制及其生物地理分布特征。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 海洋石油污染的现状与危害

1．2 海洋环境中石油烃降解微生物研究现状

1．3 低温海洋环境中石油烃降解微生物研究现状

1．4 高盐环境中石油烃降解微生物研究现状

1．5 微生物生态学的研究方法

1．6 本文研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 样品来源

2．1．2 菌株与载体

2．1．3 主要试剂和药品

2．1．4 主要仪器

2．1．5 常用培养基和溶液

2．1．6 PCR扩增引物

2．1．7 所使用的分析软件

2．2 基本方法

2．2．1 细菌基因组DNA的提取

2．2．2 降解菌群菌群总DNA的提取

2．2．3 PCR反应扩增体系

2．2．4 PCR扩增程序

2．2．5 菌落PCR

2．2．6 PCR产物的纯化

2．2．7 PCR产物的T-A连接，质粒转化及外源插入片段检测

2．2．8 变性梯度凝胶电泳(DGGE)制胶

2．2．9 DGGE条带回收、分析

2．3 北冰洋高纬度深海表层沉积物中PAHs降解菌的多样性分析

2．3．1 沉积物中PAHs成分与含量分析

2．3．2 降解菌群富集培养

2．3．3 富集菌群结构的PCR-DGGE和Solexa高通量测序分析

2．3．4 降解单菌分离鉴定

2．3．5 系统进化分析

2．3．6 降解菌群及分离单菌的降解能力验证

2．4 一株PAHs降解新菌Marinomonas profundimaris D104T(KC565667)的研究

2．4．1 模式种的选定

2．4．2 培养基

2．4．3 形态观察

2．4．4 PAHs利用范围和温度的确定

2．4．5 16S rDNA、促旋酶gyrB基因PCR扩增与分析

2．4．6 菌株脂肪酸成分的分析

2．4．7 醌和磷脂的测定

2．4．8 其它生理生化指标

2．5 红海高盐环境样品中石油烃降解菌的多样性分析

2．5．1 石油烃降解菌群构建

2．5．2 富集菌群结构的PCR-DGGE分析

2．5．3 宣集菌群中可培养菌株的分离鉴定

2．5．4 系统进化分析

2．5．5 富集菌群及可培养单菌石油降解能力验证

3 结果与讨论

3．1 北冰洋高纬度深海表层沉积物中PAHs降解菌的多样性分析

3．1．1 沉积物中PAHs含量分析

3．1．2 降解菌群结构的DGGE分析

3．1．3 降解菌群结构16S V6区的高通量测序分析

3．1．4 可培养菌株的分离鉴定与系统进化分析

3．1．5 降解菌群及分离单菌的降解能力验证

3．2 一株PAHs降解新菌Marinomonas profundimaris D104T(KC565667)的研究

3．2．1 菌株D104的16S rRNA基因系统发育树

3．2．2 形态观察

3．2．3 PAHs利用范围及温度的确定

3．2．4 菌株脂肪酸成分的分析

3．2．5 醌和磷脂的测定

3．2．6 其它生理生化指标

3．2．7 促旋酶gyrB基因PCR扩增与分析

3．3 红海高盐环境样品中石油烃降解菌的多样性分析

3．3．1 石油烃降解菌群构建

3．3．2 富集菌群结构的PCR-DGGE分析

3．3．3 红海高盐环境富集菌群中菌株的分离鉴定和系统进化分析

3．3．4 寓集菌群及可培养单菌油降解能力验证

3．4 讨论

3．4．1 北冰洋高纬度深海表层沉积物中PAHs降解菌研究

3．4．2 红海高盐环境样品中的石油烃降解菌研究

4 小结与展望

4．1 小结

4．2 主要创新点

4．3 展望

参考文献

致谢

附录