去泛素化酶USP4介导的IRF8转录因子去泛素化对调节性T细胞功能的影响

摘要

目的：
　　探讨去泛素化酶USP4介导的转录因子IRF8去泛素化对调节性T细胞功能的影响，进而为治疗调节性T细胞介导的免疫疾病、肿瘤提供理论依据以及药物靶点。
　　材料和方法：
　　利用免疫共沉淀技术，在过表系统中，研究去泛素化酶USP4能否和转录因子IRF8相互作用。从人体外周单核细胞中分离原代调节性 T细胞，进一步验证生理状态下USP4是否和IRF8结合。应用泛素化修饰实验，在过表系统中分析USP4对IRF8的泛素化修饰，同时在原代调节性 T细胞内进行验证实验。利用基因沉默技术，敲低调节性T细胞USP4并检测IRF8的泛素修饰情况，同时检测细胞因子表达水平。运用体外共培养实验，分别在调节性T细胞内沉默USP4和应用USP4抑制剂，与效应T细胞共培养，检测调节性T细胞免疫抑制功能。查阅GSE数据，分析小鼠肠癌模型肠癌癌组织和癌旁调节性T细胞USP4和IRF8的表达量。利用免疫组化分析了人肠癌癌组织和癌旁组织免疫细胞USP4和IRF8的表达水平。
　　结果：
　　过表系统中的免疫共沉淀实验表明，USP4能结合IRF8，而原代调节性T细胞内的免疫共沉淀结果与过表系统中一致，进一步证明了两者的相互作用。过表系统的泛素化分析显示，USP4通过K48位去泛素化修饰IRF8，从而稳定其蛋白表达，并且 K48位的去泛素化修饰是酶活性依赖的。同时，该修饰也在原代调节性 T细胞中得到验证。功能实验中，敲低USP4显著增加IRF8蛋白K48位的多聚泛素化，同时调节性T细胞Th2型细胞因子包括IL-4，IL-5，IL-13和IL-21表达增加。体外共培养实验结果显示，敲低USP4或者使用USP4抑制剂处理调节性T细胞都能抑制调节性T细胞的免疫抑制功能。GSE数据显示小鼠肠癌癌组织相对癌旁组织调节性T细胞USP4和IRF8表达都下降。人肠癌癌组织和癌旁组织相比，免疫细胞USP4和IRF8表达都降低。
　　结论：
　　USP4能够与IRF8结合，作为去泛素化酶介导IRF8的K48位去泛素化修饰，并且稳定其蛋白水平，从而加强调节性 T细胞免疫抑制功能。肠癌癌组织相比癌旁组织，免疫细胞USP4和IRF8都降低。

目录

声明

英文缩略词表

前言

材料与方法

1 抗体和试剂

2 HEK293T细胞及人原代调节性T细胞的培养

3 原代调节性T细胞mRNA表达水平检测

4 免疫共沉淀及Ni-NTA pull down实验

5 人调节性T细胞功能抑制实验

6 免疫组化

7 统计学分析

结果

1 USP4和IRF8的相互作用验证

2 USP4稳定IRF8蛋白水平验证

3 USP4对IRF8去泛素化验证

4 USP4通过稳定IRF8调控调节性T细胞功能验证

讨论

结论

参考文献

综述:肠道微生物相关肠炎对结直肠癌生成的影响

在校期间发表论文情况

致谢