不同氮素条件下强弱化感水稻土壤根际微生物多样性分析

摘要

植物化感作用是指一个活体植物通过向环境中释放其产生的某些次生化学物质，从而影响周围其他植物(包括微生物)的生长和发育一种化学生态学现象。利用水稻化感作用防除稻田杂草是当前农业生态学研究的热点问题之一，有望成为21世纪生物安全除草可持续农业的关键技术。 众所周知，土壤是植物实现化感作用的主要媒介，其中土壤微生物是土壤有机物转化的执行者，它可通过降解、转化等方式直接影响化感物质在土壤中的存在状态、可利用性，甚至对物质的化感活性起到决定性的作用，但相关的研究很少，而传统的微生物研究在很大程度上受到方法学上的制约，为此，本文运用未端限制性片断多态性(T—RFLP)及土壤蛋白质组学等分子生物学手段探讨了氮素胁迫条件下不同化感潜力水稻土壤微生物多样性。 根系微生物的T—RFLP研究表明：在所检测到的175个T—RFs中，属于品种差异的只有16个，由氮素和品种引起微生物的垂直分布的差异和微生物峰度的差异是主要的。总体而言，低氮条件下水稻的根圈微生物较正常氮水平下丰富，相同氮条件下，化感水稻较非化感水稻丰富。化感水稻根际微生物群落组成呈现较大的多样性，与正常氮水平下化感水稻以及非化感水稻的根际微生物相反，低氮条件下化感水稻的根系微生物多于0—5cm层的微生物，同时其0—5cm和5-20cm层的微生物也较其它样品丰富。氮素引起的化感水稻根圈土壤微生物差异包括氮循环相关的细菌，产酸和嗜酸相关的细菌如产丙酸菌等和嗜酸硫杆菌属等、产外毒素相关的梭杆菌属，信号转导和防御相关的螺旋体属，以及一些病害相关的病原菌如植原体属，支原体属、克雷伯氏菌属等的一些细菌。这可能与低氮下化感水稻分泌较多的酚酸类化感物质，为微生物提供了更充分的C源，营造了异质的土壤微生态环境有关。 同时本文还初步建立了土壤蛋白质组学技术平台，土壤蛋白质组学技术和T—RFLP技术相似之处在于，它们均在一定程度上克服了传统平板培养的微生物的研究方法中所研究的微生物只占微生物总量的0.1—10％的缺点，然而这两种技术也有差异，土壤蛋白质组学能更直接的反映土壤生态系统中的功能微生物或功能蛋白质。本文建立了一种提取和分离土壤蛋白质的方法，本方法对土壤微生物原提取效率达37.5％。 综上所述，本文利用T—RFLP技术探讨了不同氮素条件下不同化感潜力水稻根际微生物的多样性，同时也初步建立了土壤蛋白质组学分析技术平台，这在国内外仅有少量几篇报道，且存在着重复性不够高的问题，本文多种分子生物学方法的联合运用有效避免单一方法的“假阳性”，进一步完善土壤蛋白质组学的研究技术平台。本文研究结果将为化感微生物的筛选与化感指示微生物的分离与鉴定打下坚实的基础。

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第一章 文献综述

1.1水稻化感作用研究

1.2微生物对化感作用潜力的影响

1.3目前微生物研究的概况

1.4当前土壤微生物研究的几个趋势

1.4.1对土壤生态系统中的动植物微生物进行地上地下的生物综合研究

1.4.2不同地域之间研究的综合，进行国际合作、建立和扩展数据库

1. 4.3不同类型生态系统之间的比较

1.4.4由传统方法到分子技术，由宏观研究到微观研究的发展

1.4.5微生物多样性研究继续深入，不断发现新的微生物类群

1.4.6以PCR为基础的分子生物学技术

1.4.7宏蛋白质组学技术

1.5问题与展望

1.6本研究的目的和意义

第二章不同氮素水平下化感水稻与非化感水稻根际微生物的T—RFLP分析

2.1材料与方法

2.1.1实验设计

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1土壤基因组DNA，16rDNA的PCR扩增与酶切产物的电泳检测

2.1.2 T—RFLP图谱的建立与供试土壤微生物群落组成分析

2.4结论与讨论

第三章不同氮素水平下化感水稻与非化感水稻根际土壤蛋白质组学技术的初步建立

3.1实验材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2样品处理

3.1.3样品裂解

3.1.4定量分析：

3.1.5 SDS—PAGE电泳

3.1.6土壤微生物的荧光显微镜观察

3.2结果与分析

3.2.1电泳结果

3.2.2微生物的得率：

3.2.3土壤微生物的荧光显微镜观察

第四章结论与展望

4.1结论

4.2展望

主要参考文献

附件

致谢