产胞外多糖南极微生物的筛选及其胞外多糖的应用研究

摘要

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是微生物在生长过程中分泌到周围环境中的由多种单糖组成的大分子物质，具有来源广、易与菌体分离等优点。极地微生物的胞外多糖具有许多不同的生物活性和新颖的化学结构，在医药、食品加工、化工等领域具有广阔的应用前景。本文采用苯酚硫酸法和醇沉法从10种不同的南极泥沙沉积物样品中共筛选到132株产不同胞外多糖量的菌株，其中（A）产量低于20 mg/L的有7株，占产EPS菌株的5.3％；（B）产量在20-60 mg/L的有25株，占产EPS菌株的18.94%；（C）产量在60-100 mg/L的有79株，占产EPS菌株的59.85%；（D）产量高于100 mg/L的有21株，占产EPS菌株的15.91%。其中来自不同筛选样品、不同筛选批次产EPS量相对较高菌株W38-8、W29-21、W32-2、W13-13、W38-16、W32-3、W14-6、W18-3和W20-15，产量最高的三株菌分别为W38-8、W29-21、W32-2，对应的EPS产量分别为144.22 mg/L、125.61 mg/L、109.56 mg/L。经过16S rDNA基因序列比对鉴定，这9株菌分别是Loktanella salsilacus，Rheinheimera soli，Shewanella frigidimarina，Planococcus halocryophilus，Marinobacter sp.， Shewanella sp.，Pseudomonas stutzeri，Planococcus halocryophilus， Flavobacterium sp。
　　本研究主要内容包括：⑴针对培养条件较稳定的W32-2菌株（Shewanella frigidimarina，EPS产量为109.56 mg/L），从多糖理化性质及体外抗氧化活性、多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性影响及EPS生产的发酵工艺等三个方面开展深入研究。⑵采用Sevage法除蛋白后，考马斯亮蓝测定结果表明，W32-2粗多糖的蛋白含量仅为0.5%；硫酸咔唑法测得W32-2胞外多糖的糖醛酸含量为8.46%；明胶比浊法测得EPS的硫酸基含量为83.35%，为酸性多糖。DPPH和超氧阴离子清除实验结果显示，W32-2产生的EPS对DPPH有一定的清除能力，当质量浓度为0.5 mg/mL时，抗氧化能力最强，对DPPH的清除能力达60.43%，对超氧阴离子的清除率达70.03%。⑶菌株W32-2所产EPS对彩虹鲷血液的非特异性免疫酶活初步实验结果表明，该EPS在一定程度上可以提高彩虹鲷非特异性免疫酶活。实验条件为：a）EPS浓度为3 mg/mL，b）EPS浓度为5 mg/mL， c）pH7.4的1×PBS，注射剂量均为0.1mL，分别在注射后第3 d、5 d、7 d、14d、21d和28d测其血清酶活。测试数据表明，注射EPS浓度为3 mg/L实验组的免疫增强效果较好。在整个实验期间，AKP活性最高是对照组的2.29倍，且在第三天达到最大；在实验第7 d时ACP酶活比对照组提高了51.18%，且SOD活力达最大值；在第14 d时，实验组比对照酶活提高了33.25%；在第3 d时，实验组的CAT酶活比对照提高了57.64%。该结果表明，菌株W32-2产生的 EPS具有作为免疫添加剂的潜力。⑷通过单因子变量实验，确定W32-2产EPS的最佳碳源为果糖，最佳添加量为4%；最佳氮源为酵母提取物，最佳添加量为2%；最佳培养基初始pH值为9；最佳发酵温度为10℃；最佳装液量为150/500 mL；最佳接种量为3%。

目录

声明

1 前言

1.1 极地与极地微生物

1.2 微生物多糖的研究概况

1.3 胞外多糖的研究概况

1.4 本研究的意义及内容

2 南极产胞外多糖微生物的筛选及系统发育分析

2.1 材料与方法

2.2 产胞外多糖南极微生物的筛选

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

3 南极微生物胞外多糖的理化性质及生物活性研究

3.1 材料

3.2 主要试剂与仪器

3.3 南极微生物胞外多糖理化特征分析

3.4 南极微生物胞外多糖体外抗氧化活性的测定

3.5 结果与分析

3.6 本章小结

4 南极微生物粗多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性的初步探究

4.1 材料

4.2 粗胞外多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性影响的实验

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

5 产胞外多糖南极微生物的发酵条件优化

5.1 材料

5.2 培养基成分对菌株W32-2产胞外多糖能力的影响

5.3 发酵条件对菌株W32-2产胞外多糖能力的影响

5.4 结果与分析

5.5 本章小结

6 总结与展望

6.1 总结

6.2 展望

参考文献

攻读硕士期间的学术论文与研究成果

致谢