水稻条纹病毒(RSV)编码的SP蛋白的结构与功能初探

摘要

水稻是目前世界人口最重要的粮食作物之一，但是，水稻因为各种各样的病虫害导致的产量下降却屡见不鲜，其中包括严重影响我国水稻产量的一种单链RNA病毒----水稻条纹病毒（Rice stripe virus， RSV）。文献报道发现，水稻条纹病毒主要侵染水稻、烟草、甚至玉米等的叶片，使叶片出现枯色条纹状病变。关于水稻条纹病毒如何作用于宿主植物，包括，病毒蛋白如何通过宿主发挥其毒害作用的机制还不清楚。因此，开展关于水稻条纹病毒蛋白与宿主水稻蛋白之间的互作关系的研究具有十分重要的意义。研究发现，水稻条纹病毒的第四条RNA链正向控制编码的一种致病特异蛋白（disease-specific protein，SP）可能是参与病毒侵染植物，发挥其致病作用的一种关键蛋白。
　　本研究以该蛋白为重点，以期解析其结构；通过寻找该蛋白作用于宿主水稻的靶标蛋白，解析互作复合体的结构，从而分析其可能的致病机理。首先，论文采用大肠杆菌表达系统，体外表达SP蛋白，利用亲和纯化的方法，纯化获得该蛋白，并以期得到该蛋白的晶体，然后优化出最佳衍射数据的晶体，从而解析该蛋白的分子结构，分析其可能与宿主靶标蛋白互作的结构域或蛋白序列。其次，以新鲜的水稻叶片为材料，进行叶片全蛋白的提取，并将SP蛋白与MBP标签和GST标签融合表达。最后，利用pull-down技术，将纯化好的含有不同标签的SP蛋白与水稻叶片全蛋白进行孵育后，除去非特异性结合的杂蛋白，进行SDS-PAGE检测，银染显色，核磁鉴定互作蛋白的序列，并以期获得二者互作的晶体结构，分析互作的关键位点。结果显示：体外表达获得了大量的纯度较高的SP蛋白；戊二醛交联实验标明该蛋白可能存在通过自身互作形成三聚体；报道称发现SP可与水稻叶绿体光合作用复合体Ⅱ中的PsbP蛋白互作，但根据等温滴定量热法（ITC）测定二者互作关系，未显示其可明显发生互作；有报道标明，SP可能与某些短肽互作，但ITC结果未发现有明显的互作关系；目前还未得到该蛋白的晶体衍射数据；该蛋白与水稻叶片全蛋白的pull-down结果还未发现特异的互作蛋白。

目录

声明

第一部分 引言

1 水稻条纹病毒简介

1.1 水稻条纹病毒的危害及分布

1.2 水稻条纹病毒的基本特征

1.3 水稻条纹病毒的传播途径

1.4 水稻条纹病毒编码蛋白简介

2 植物RNA病毒与植物互作的生物学意义

2.1 RNA病毒侵染植物的组装方式

2.2 病毒的致病反应及宿主的防护机制

3 水稻条纹病毒编码的SP蛋白的结构生物学研究

4 结构生物学研究方法

5 蛋白质表达纯化基本方法

5.1 亲和纯化

5.2 离子交换层析分离

5.3 凝胶过滤层析

第二部分 研究内容

1. 实验材料

1.1载体和菌株

1.2 主要实验仪器

1.3主要试剂

1.4 常用的缓冲溶液和培养基

2. 实验方法

2.1 全长基因的扩增

2.2 载体的提取

2.3 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

2.4 重组质粒的构建

2.5 转化

2.6 小量诱导表达

2.7 大量表达目的蛋白

2.8 目的蛋白的纯化

2.9 分子排阻层析法蛋白纯化

2.10 植物全蛋白的提取

2.11 SP蛋白与互作因子的互作分析

2.12 SP蛋白的靶标蛋白筛选

2.13 SDS-PAGE银染

2.14 戊二醛交联实验

3 实验结果

3.1 蛋白的表达与纯化

3.2 SP蛋白晶体生长条件的初步筛选

3.3 SP蛋白与水稻PsbP蛋白的相互作用

3.4 SP蛋白与某些短肽相互作用的检测

3.5 SP蛋白自身互作的检测

3.6 SP蛋白与水稻蛋白互作因子的筛选

第三部分 结论和讨论

1 SP蛋白与水稻PsbP相互作用

2 SP蛋白自身互作

3 SP蛋白与水稻蛋白作用因子的筛选

4 结论

第四部分 水稻条纹病毒CP蛋白的表达

参考文献

附录 附录题名

致谢