当归多糖减轻骨髓基质细胞氧化应激延缓造血干/祖细胞衰老

摘要

骨髓造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs）的自我更新和多向分化潜能受到造血微环境的调控。文献报道生理性衰老和放、化疗等诱因可致骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)衰老，但衰老造血微环境对造血干细胞的影响及其作用机制尚不清楚。活性氧（ Reactive oxygen species,ROS）水平对造血干细胞的生理活动起着重要作用。细胞内ROS水平较低的造血干细胞具有长期的自我更新能力，而胞内聚积过多的ROS会引起氧化应激（Oxidative stress），诱发DNA损伤，导致造血干细胞发生应激诱导性早衰（ Stress-induced premature senescence, SIPS）。缝隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）主要表达于骨髓基质细胞，作为骨髓基质细胞与造血干细胞之间缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular conmmunication, GJIC）的基本结构与功能蛋白，可将造血干细胞内ROS转移至骨髓基质细胞中，调控HSC与BMSC间的ROS水平，是降低造血干细胞氧化应激与促进正常造血的必要条件。本研究用D-半乳糖体外诱导骨髓基质细胞衰老，建立骨髓基质细胞与造血干/祖细胞共培养体系，观察衰老骨髓基质细胞的生物学特点及生物活性变化，及其对造血干/祖细胞的影响。
　　当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）是从祖国传统中药当归中分离、提取的有效药用成份，具有调控造血、抗辐射损伤、抗肿瘤和免疫调节等作用。本课题组前期研究表明，当归多糖可延缓大鼠骨髓基质细胞衰老并可通过该作用而促进造血细胞增殖分化，但当归多糖调控骨髓基质细胞与造血细胞之间的关系尚未阐明。本研究进一步探讨当归多糖对骨髓基质细胞氧化应激、细胞组分、Cx43表达和分泌活性因子的影响；通过体外造血干/祖细胞与衰老骨髓基质细胞共培养体系，研究当归多糖维持低氧造血微环境对造血干细胞氧化应激的影响，为从骨髓微环境角度探讨当归多糖调控造血干/祖细胞衰老提供实验依据和理论基础。
　　方法：
　　1.D—半乳糖（D-Gal）建立BMSCs体外衰老模型，探讨衰老骨髓基质细胞氧化应激、细胞组分、缝隙连接蛋白Cx43表达和分泌活性因子的变化，以及当归多糖对衰老骨髓基质细胞的调控：无菌条件下取C57小鼠双侧股骨和胫骨，制备全骨髓细胞悬液，体外培养BMSCs至F3代，进行后续相关实验检测。实验分组：对照组：常规培养96h；衰老组：常规培养体系内加入D-Gal30mg/ml培养96h；ASP组：常规培养体系中加入100μg/mL ASP培养96h；ASP延缓衰老组：30mg/mL D-Gal作用BMSCs48h后，加入100μg/mL ASP继续培养48h。采用SA-β-Gal染色、流式细胞周期检测分析BMSCs衰老生物学指标；免疫荧光和流式技术检测BMSCs内ROS水平，实时定量PCR检测BMSCs RUNX2和PPARγ的基因表达，免疫荧光检测BMSCs缝隙连接蛋白Cx43的表达，荧光黄划痕传输技术测定Cx43功能；免疫荧光检测SDF-1的表达，ELISA法检测BMSCs培养上清液中IL-1β, IL-6, TNF-α和RANTES的含量。
　　2.建立BMSCs与骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells， BMNCs）共培养模型，观察衰老骨髓基质细胞对造血细胞氧化应激的影响以及当归多糖的调控作用：提取BMNCs贴壁培养6h去除其中的BMSCs，收集悬浮的BMNCs，调整细胞浓度为1×106个/mL与上述四组BMSCs模型共培养，48h后收集造血细胞做后续相关检测。采用台盼蓝染色计数活细胞，流式细胞周期分析，SA-β-Gal染色检测BMNCs衰老生物学指标，流式细胞术检测细胞内ROS水平，Western Blotting检测造血细胞衰老信号蛋白P53、P21、P38、P16的变化。
　　3.建立 BMSCs与 Sca-1+造血干/祖细胞（ Hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells，HSCs/HPCs）共培养模型,研究ASP调控衰老骨髓基质细胞对造血干/祖细胞氧化应激的影响：免疫磁珠分离提取Sca-1+细胞，与上述4组BMSCs共培养48小时.收集悬浮Sca-1+细胞进行相关实验检测。采用CFU-Mix体外培养、集落计数方法检测BMSCs对造血干/祖细胞增殖分化能力的影响；激光共聚焦观察Sca-1+细胞内ROS荧光强度；流式细胞术检测DNA损伤指标γH2AX，ELISA法检测8-OHdG的含量，实时定量PCR检测Sca-1+细胞P53、P21、P38、P16的基因表达，激光共聚焦观察Sca-1+细胞内P38的蛋白表达。
　　结果：
　　1.衰老BMSCs细胞周期阻滞于G1期，衰老细胞特异性SA-β-Gal染色阳性率明显增加；胞内ROS水平明显升高；成骨分化基因RUNX2表达显著降低，成脂分化基因PPARγ表达显著上升；缝隙连接蛋白Cx43表达减少，BMSCs荧光染料传输能力降低；衰老BMSCs分泌SDF-1明显降低；炎性因子 IL-1β, IL-6, TNF-α和促炎因子RANTES的分泌显著上升。当归多糖作用后减轻BMSCs细胞周期阻滞，SA-β-Gal染色阳性率降低；胞内ROS水平降低，BMSCs成骨/成脂比例上升；Cx43蛋白表达及功能回升；SDF-1分泌增加，IL-1β、IL-6、TNF-α、RANTES分泌减少。
　　2.与衰老组BMSCs相比，ASP延缓衰老组的BMSCs SA-β-Gal染色阳性率降低，G1期细胞比例下降、S期细胞比例上升；ROS水平明显降低；成脂分化基因PPARγ表达显著降低，成骨分化基因RUNX2表达显著上升；Cx43蛋白表达及功能增强；SDF-1分泌增加，IL-1β、IL-6、TNF-α、RANTES分泌减少。
　　3.与衰老组BMSCs共培养后造血细胞活细胞计数减少；细胞周期阻滞于G1期，SA-β-Gal染色阳性率增高；胞内ROS水平增高；衰老相关蛋白P53、P21、P38、P16表达明显上调。与衰老组BMSCs共培养的相比较，与ASP延缓衰老组BMSCs共培养后造血细胞活细胞计数显著增加；G1期细胞比例下降，S期细胞比例升高；SA-β-Gal染色阳性率下降；胞内ROS水平降低；衰老相关蛋白P53、P21、P38、P16表达明显下调。
　　4.与衰老组BMSCs共培养后Sca-1+细胞CFU-Mix集落形成数量显著减少；胞内ROS荧光表达明显增强，γH2AX和8-OHdG的含量显著上升；P53、P21、P38、P16衰老相关信号基因表达明显上调，P38蛋白荧光表达量也明显上调。与衰老组BMSCs共培养的相比较，与ASP延缓衰老组BMSCs共培养后Sca-1+细胞CFU-Mix集落形成能力提高，胞内ROS荧光表达明显减弱，γH2AX和8-OHdG的含量显著降低；P53、P21、P38、P16基因和P38蛋白表达下调。
　　结论：
　　1.衰老骨髓基质细胞氧化应激增强导致骨髓造血微环境改变：骨髓基质这一异质细胞群的细胞组成发生改变、Cx43蛋白表达下调与功能降低、缓解造血干/祖细胞氧化应激能力下降、分泌生物活性物质改变。
　　2.衰老骨髓造血微环境抑制骨髓造血干/祖细胞增殖分化，其机制可能是衰老造血微环境的活性氧负荷增强同时缓解造血细胞活性氧的能力减弱，导致造血干/祖细胞发生应激诱导性早衰即氧化应激诱发DNA损伤所致细胞衰老。
　　3.当归多糖通过改善造血微环境而延缓造血干/祖细胞衰老，其机制可能与减轻骨髓基质细胞和造血干/祖细胞的氧化应激、上调缝隙连接蛋白Cx43，降低造血干/祖细胞DNA氧化损伤，抑制衰老相关蛋白表达有关。

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第一部分 当归多糖调控骨髓基质细胞衰老的生物学特点

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 当归多糖延缓骨髓基质细胞衰老

2.2 当归多糖减轻骨髓基质细胞氧化应激

2.3 当归多糖对骨髓基质细胞成骨成脂分化方向的影响

2.4 当归多糖促进骨髓基质细胞表达缝隙连接蛋白Cx43

2.5 当归多糖对骨髓基质细胞分泌细胞因子的影响

3 讨论

参考文献

第二部分 当归多糖调控骨髓基质细胞衰老对造血干/祖细胞氧化应激的影响

前言

1 实验材料和方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Sca-1+造血干/祖细胞的分离纯化及鉴定

2.2 当归多糖调控骨髓基质细胞对造血细胞衰老的影响

2.3 当归多糖调控骨髓基质细胞对造血干/祖细胞氧化应激致DNA损伤的影响

2.4 当归多糖调控骨髓基质细胞对造血干/祖细胞信号通路的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述: 氧化应激对骨髓基质细胞的影响及其研究进展

致谢

攻读学位期间研究成果与发表的学术论文